【摘要】 研究大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞（retinal ganglion cell, RGC）的非折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。方法：成年雄性SD大鼠28只经视神经夹伤后，在4，8，12，24，72，168h，通过免疫荧光组织化学染色法观察RGC中非折叠蛋白相关因子（PERK，IRE1，calnexin）、AMPA受体亚基GluR2的表达；采用FluoroJade C法染色显示RGC凋亡状况，并与正常对照组比较。结果：大鼠视神经夹伤后，与正常对照组相比，RGC表达PERK，calnexin明显增强。从损伤后4h，阳性RGC细胞数增加，至24h时达到峰值，PERK，calnexin阳性细胞数分别为15.00±0.36和11.75±1.44个，与对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。从损伤后8h，RGC的IRE1及GluR2表达增强，其中GluR2在胞膜上表达明显增强；FluoroJade C染色在72h时RGC出现表达，并与GluR2的表达双标。结论：大鼠视神经夹伤后，与UPR相关的PERK，IRE1，calnexin在RGC表达明显增强，提示UPR可能参与了RGC的凋亡。
【关键词】 非折叠蛋白反应 视神经钳夹伤 视网膜节细胞 大鼠
0引言
视网膜视神经疾病包括视神经外伤、视网膜色素变性、视神经炎、青光眼等，可使视力严重而不可逆性受损，且缺乏有效的治疗方法，已成为人类主要致盲因素之一[1]。其本质特征是视网膜节细胞(RGC)及其纤维的渐进性死亡。作为中枢神经系统一部分，RGC死亡后不能有效再生，其确切死亡机制一直是神经损伤与再生研究的重点[24]。大量实验发现，神经元在外伤、炎症等因素刺激下，首先表现为内质网中大量非折叠蛋白的蓄积，从而触发细胞的一系列反应，统称非折叠蛋白反应（UPR）[5]，并已证实为多种中枢神经变性疾病中神经元死亡的最早原因[610]， Ryoo等[11]指出，UPR可能还是视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡的首发病理机制。我们利用大鼠视神经钳夹损伤模型，通过免疫荧光组织化学双重标记法、FluoroJade C法染色观察RGC中非折叠蛋白相关因子（PERK，IRE1，calnexin）、AMPA受体亚基GluR2及凋亡细胞的表达，并分析其相互关系，探讨UPR在视神经损伤中的作用与反应机制，进而为阐明视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡机制，寻求视神经保护方法提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
成年雄性SD大鼠28只，体质量220～250g，由第四军医大学实验动物中心提供，外眼正常，对光反射灵敏，检眼镜查屈光介质清晰，眼底无异常，予以12h明暗交替光照, 不限食水, 室温18～ 23℃条件下饲养。兔抗大鼠PhosphoPERK(Thr980)(16F8)mAb,兔抗大鼠Calnexin抗体，兔抗大鼠IRE1α(14C10)mAb，购自美国Cell Signaling公司ER stress antibody sampler kit，AMPA受体亚基GluR2mAb（美国Sigma公司），FluoroJade C(美国Chemicon 公司)。
1.2方法
按随机数字方法将动物分为对照组(4只)、损伤组（夹伤后不同时间组即4，8，12，24，72，168h，共6组，每组4只）。用10g/L戊巴比妥钠注射液（60mg/kg）ip麻醉大鼠，剃掉头部上方体毛，10g/L碘伏消毒，从双耳连线中点向前剪开皮肤至近鼻部，丝线拉开皮肤暴露左眶部（图1A），手术显微镜（德国Leica M651）下沿左眶上缘剪开筋膜至巩膜表面，去除大部分泪腺，分离上直肌并用50尼龙线拉向头侧，分离外直肌同法拉向尾侧并固定（图1B），暴露出视神经根部，沿视神经纵轴方向谨慎挑开鞘膜，避免伤及视网膜动脉，反向镊以垂直角度于球后2mm处钳夹视神经20s（图1C），缝合结膜及皮肤。次日观察术眼及眼底，选择无感染、无视网膜缺血表现的大鼠进行实验。对照组动物不夹伤视神经，余操作同损伤组。建模后，按各时间点麻醉大鼠，行升主动脉插管，快速灌注生理盐水约100mL后继续灌注含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB, pH 7.4) 400mL,先快速灌注其中200mL，后200mL持续灌注固定2h，灌毕立即取手术眼球，置入含250g/L蔗糖的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中, 4℃过夜。冰冻切片机（德国Leica CM1900）中将眼球以矢状位连续切片,片厚12μm。对照组及每个损伤组切片4套。
1.2.1免疫荧光组织化学
各组取3套切片晾片2h，分别入兔抗大鼠PERK(1∶300)、兔抗大鼠calnexin（1∶300）、兔抗大鼠IRE1（1∶300）＋AMPA（1∶400），室温下孵育过夜；分别加入Texas Red标记的驴抗兔抗体(1∶800,Molecular Probes)，IRE1＋AMPA双标组切片加入Texas Red标记的驴抗兔抗体(1∶800,Molecular Probes)和FITC标记的驴抗兔抗体(1∶400,Molecular Probes),室温下孵育2h，700ml/L甘油封片。以上各步骤间均经0.01mol/L PBS清洗30min。Olympus FluoView 300激光扫描共聚焦显微镜观察并采图。采用杜兆江等[12]方法进行神经节细胞计数，每张切片取4～5 个视野，在40倍视野下以10μm ×10μm ×10μm 的网格对视网膜中PERK或calnexin表达阳性的神经节细胞计数,共计10 个单元格,每个标本计数3 个不同位置。
1.2.2 FluoroJade C法染色
切片入含10g/L NaOH的800mL/L乙醇5min，700mL/L乙醇2min，双蒸水2min，0.6g/L KMnO4(高锰酸钾)溶液10min，后浸于双蒸水2min，转入4mg/L FluoroJade C的1mL/L乙酸溶液，置脱色摇床上轻轻摇动10min。双蒸水漂洗1min，共3次，70%甘油封片。Olympus FluoView 300激光扫描共聚焦显微镜观察并采图。
统计学处理:实验结果应用SPSS11.0软件处理数据，各损伤组与对照组间差异采用Dunnettt检验进行分析，设定显著性水平P＜0.05。
2结果
大鼠视神经夹伤模型建立后，大鼠摄食饮水正常，无明显质量减轻，未见伤口感染及眼底缺血表现。视神经夹伤后，对PERK或calnexin表达阳性的RGC的计数结果显示，各损伤组calnexin和PERK表达阳性的RGC数均较对照组增加，与对照组相比具有显著性差异（P<0.05）,从损伤后4h开始表达阳性RGC数逐渐增加，至24h时达到峰值（calnexin，11.75±1.44；PERK，15.00±0.36），之后72h与168h组较24h组阳性RGC表达数明显减少，各损伤组RGC层PERK和calnexin的表达均比对照组增强，从4h开始至24h达到高峰后逐渐减弱；与对照组相比，损伤后8h的各个时间点，均可见IRE1α与AMPA（GluR2）在RGC层表达增强，其中GluR2在胞膜上表达明显增强；FluoroJade C染色在视神经夹伤后72h组，可见大鼠RGC出现阳性反应，并与GluR2的表达呈现双标，同时内核层个别双极/无长突细胞也出现FluoroJade C阳性反应，但GluR2表达阴性。
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