【摘要】 研究二肽基肽酶II（dipeptidyl peptidase II,DPPII）在D半乳糖性白内障大鼠晶状体和正常大鼠晶状体中含量的变化，探讨DPPII与白内障发病的关系。方法：建立D半乳糖性白内障大鼠动物模型，进行相应分期分组，应用Western blot方法检测DPP II在各组白内障大鼠及正常大鼠晶状体中含量变化。结果：DPPII在各组D半乳糖性白内障大鼠晶状体中的含量明显高于同期正常对照组，并且随着晶状体混浊程度的加重而增加。结论：DPPII在D半乳糖性白内障大鼠晶状体中的含量增加，可能与白内障发病相关。
【关键词】 二肽基肽酶II Western blot 白内障 晶状体
0引言
白内障是全球第一位致盲眼病，年龄相关性白内障是最为常见的白内障类型。随着白内障病因学研究的不断深入，许多国内外专家学者认为晶状体蛋白的不可逆变性是导致白内障形成的主要原因[1,2]。
外切肽酶中的二肽基肽酶II（dipeptidyl peptidase II, DPPII）是一种细胞内溶酶体蛋白酶，通过它在不同细胞、体液及器官中的定位，已有学者证明DPPII在细胞分化和防止细胞死亡的过程中发挥重要作用；并在胶原片断、肌纤维蛋白和短神经肽的降解中发挥作用[3]。我们通过检测DPPII在正常大鼠和D半乳糖性白内障大鼠晶状体中含量的变化，探讨DPPII与白内障发病的关系，为白内障的病因学研究提供新的理论依据。
1材料和方法
1.1材料
5～6wk龄的两性Wistar大鼠60只（吉林大学医学院实验动物中心提供），体质量50～60g，雌雄兼用，经美多丽眼药水（日本参天制药株式会社提供）散瞳后裂隙灯检查其晶状体均透明。将大鼠随机分为正常对照组20只和半乳糖性白内障组即实验组40只。动物常规消毒，给实验组大鼠500g/L D半乳糖（捷瑞生物工程有限公司产品）溶液15g/kg，2次/d，ip；对照组大鼠同期等量无菌生理盐水，连续7～28d。定期给各组大鼠散瞳，裂隙灯下观察其晶状体的动态变化。按晶状体混浊性质及程度分为 I期(注射后1wk)：囊泡期；II期(注射后2wk)：皮质期；III期(注射后3wk)：成熟期；IV期(注射后4wk)过熟期。分别脱臼处死各期实验组大鼠和正常对照组大鼠，每期每组处死5只，取晶状体，分组分装后80℃保存。为了提高DPPII目的蛋白的含量，以助于观察其在白内障早期和晚期的变化，将实验动物人为分组：晶状体出现I，II期改变的大鼠划分为轻度白内障组，即实验1组；晶状体出现III，IV期改变的大鼠划入重度白内障组，即实验2组。正常对照组与实验组同期分为对照1组和对照2组。表1 PVDF膜上各DPPII蛋白条带的灰度分析值（略）
1.2方法
取各组大鼠晶状体各10枚，分别置于1mL样品缓冲液（50mmol TrisHCl，pH值8.0，2mmol EDTA，1mmol 2巯基乙醇）中，冰盒中匀浆搅碎，4℃离心，3000r/pm，20min，取上清，分装，80℃保存。用考马斯亮兰法（bradford法）测定各组样品的总蛋白浓度，根据所测得样品的总蛋白浓度，将各组样品总蛋白浓度调至相同水平备用。配制100g/L的分离胶，50g/L的浓缩胶，厚度1.0mm。将自备好的各组样品4倍稀释后加入1×SDS上样缓冲液，100℃水浴3min。加样，顺序依次为：DPPII蛋白纯品（吉林大学分子酶学工程516实验室从大鼠肾脏中提取），对照1组，实验1组，对照2组，实验2组，蛋白Marker（华特生生物技术有限公司产品），上样量为20μL/槽。恒流电泳，前沿条带跑至分离胶底沿时终止电泳。半干式电转110min,将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转至PVDF膜（Amersham公司产品）上。标记蛋白Marker。30g/L BSA封闭，37℃，55min。一抗（吉林大学分子酶学工程516实验室制备DPPII兔抗鼠多克隆抗体）（1∶500）封闭，4℃过夜。二抗（羊抗兔抗体，Santa Cruz生物技术公司产品）（1∶2000）封闭，室温4h。DAB显色液（武汉博士德试剂有限公司产品），37℃，显色30min。照相，封存。利用Bandscan灰度扫描软件进行结果分析。
2结果
2.1 D半乳糖性白内障大鼠模型
裂隙灯显微镜下观察，正常对照组20只大鼠晶状体始终保持透明，实验组大鼠均出现不同程度的晶状体混浊。注射后1wk可观察到实验组大鼠晶状体周边出现空泡，晶状体呈轻度混浊；注射后2wk，晶状体周边空泡向中心扩展，中心核出现雾状混浊，晶状体混浊呈中度；注射后3wk，空泡扩展到核区，中心核雾状浑浊加重，晶状体呈高度浑浊；注射后4wk，整个晶状体呈肉眼可见的混浊。对照组大鼠无死亡。实验组大鼠发生死亡18只。
2.2大鼠晶状体中DPPII的含量
DPPII蛋白纯品条带出现在Marker带中蛋白分子质量为66kDa的下方，约为60kDa大小的位置；4组样品在DPPII蛋白纯品的同水平位置上均有条带出现，并且实验1组较对照1组显色深；实验2组较对照2组及其他两组显色均加深；对照2组较对照1组显色加深（图1）。应用Bandscan软件测各组样品DPPII蛋白条带的总灰度值 (total gray)及总灰度值的对数值 (log of total gray)，3次，取平均值（表1）。比较PVDF膜上各组样品中DPPII蛋白条带的显色情况，结合各组DPPII蛋白条带的总灰度值及其对数值的对比，得出结果：1）实验1组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于对照1组；实验2组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于对照2组。即实验组晶状体中DPPII的含量明显高于同期对照组。2）实验2组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于实验1组。3）对照2组大鼠晶状体中DPPII的含量高于对照1组。
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