【摘要】 探讨胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在青光眼大鼠视网膜Müller细胞上的诱导表达情况及可能的意义。方法：采用烧灼涡静脉的方法制作大鼠青光眼模型，分别于术后2h；1，3d；1，2，3wk取材，制作视网膜矢状位冰冻切片和视网膜铺片，进行GS/GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总蛋白行GFAP免疫印迹半定量分析。结果：视网膜矢状位切片可见，正常大鼠视网膜中，GFAP阳性染色只出现在神经节细胞层的星形胶质细胞上，而Müller细胞不表达GFAP。制作青光眼模型术后2h，Müller细胞上出现GFAP阳性染色，术后1，3d，GFAP的表达显著增加，到术后1wk，GFAP在Müller细胞上的表达量达到高峰,一直持续到术后3wk，免疫印迹半定量分析与以上结果吻合。术后1wk视网膜铺片中清晰可见Müller细胞足板出现GFAP的诱导表达。结论：高眼压时GFAP在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达是Müller细胞对眼压升高产生的一种反应，GFAP可能是一种潜在的有用的生物标记物。
【关键词】 青光眼 Müller细胞 GFAP
0引言
青光眼是一种以视网膜神经节细胞逐渐丧失为特征的视神经病变，伴随明显的视盘和视野改变。视网膜神经节细胞在受到原始损伤后引发一系列的反应，最终导致神经节细胞的凋亡或坏死，从而引起视功能的改变。视网膜是中枢神经系统的一部分，不仅含有神经元细胞，还含有大量的神经胶质细胞。视网膜中的神经胶质细胞特别是Müller细胞具有营养、支持和保护神经元的作用。青光眼视网膜神经节细胞丢失和神经纤维层丧失后由Müller细胞和星形胶质细胞的突起代替。正常大鼠视网膜中只有星形胶质细胞表达细胞骨架蛋白GFAP，而Müller细胞不表达GFAP，星形胶质细胞和Müller细胞同属于神经胶质细胞，并且在功能上有协同作用。我们建立了大鼠青光眼模型，探讨眼压升高后GFAP在视网膜中的表达情况及可能的意义，为积极采取干预措施保护原发损害后幸存的神经元以及边缘性损害的神经元，减缓青光眼病变进展提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
健康SD大鼠42只，雌雄不限（180～240g，2mo龄），购自新加坡国立大学实验动物中心，室内分笼饲养，饲养室采用循环日光灯照射（12h光照/12h黑暗），室温22～24℃。实验动物均排除眼部及全身疾病，所有实验操作方案遵循ARVO“眼科和视觉科学实验动物使用规范”。其中3只用于正常对照，另外39只右眼制作青光眼模型，左眼行假手术。操作中尽量减少动物痛苦及意外致动物死亡。参考Wang等[1,2]方法制作大鼠青光眼模型，按350mg/kg ip 70mL/L水合氯醛对大鼠进行麻醉。测量并记录双侧眼压，剪开上方球结膜暴露3条球涡静脉，烧灼器烧灼3条涡静脉，封闭结膜囊，2h后测量并记录眼压。所有大鼠右眼制作青光眼模型，左眼仅剪开球结膜暴露涡静脉作为对照。眼压测量时间选择在每天上午09∶00～10∶00，按350mg/kg ip 70mL/L水合氯醛对大鼠进行麻醉，10g/L的卡因表面麻醉2次，根据操作说明用TonoPen XL手持式眼压测量仪进行眼压测量。除术前、术后测眼压外，分别于相应时间点测量并记录眼压。针对每只大鼠连续测量3次取平均值，3次眼压测量值之间相差不超过3mmHg。右眼眼压较左眼眼压至少高25％才认为模型制作成功。
1.2方法
其中24只大鼠用于免疫组织化学研究（3只正常对照，18只青光眼模型用于视网膜矢状位免疫组化研究（术后2h；1，3d；1，2，3wk取材，每组3只），3只青光眼模型用于视网膜铺片免疫组化研究），40g/L多聚甲醛灌注固定取眼球。后固定4h，200g/L蔗糖溶液4℃过夜，39只大鼠眼球行矢状位冰冻切片，片厚20μm，切取部位出现视神经后随机每9片取1张裱在明胶处理过的载玻片上，自然风干后置20℃冰箱保存备用。6只（正常对照和术后1wk，每组3只）大鼠眼球剪开眼前节，轻轻剥离视网膜，做六道放射状切口使视网膜能够平铺，行视网膜铺片免疫组织化学研究。其中18只大鼠用于Western blotting研究（术后2h；1，3d；1，2，3wk取材，每组3只），过量麻药处死大鼠，迅速取出眼球置冰上，去除眼前节挤出灰白色的视网膜组织收集于小试管中迅速放入液氮中。每个视网膜组织约加入蛋白裂解液150μL，高速研磨机上研磨30s，4℃，13000r/min高速离心25min，取上清，试管置冰上。按蛋白定量试剂盒（BioRad，Hercules，CA,USA）方法测量，酶标仪读数，记录蛋白浓度。按照预实验结果30μg/管进行分装，视网膜蛋白提取液置70℃冰箱保存备用。
1.2.1免疫组织化学检测GFAP表达
取相应时间点视网膜冰冻切片（正常对照，术后2h；1，3d；1，2，3wk）或视网膜铺片组织（正常对照，术后1wk），0.01mol/L PBS洗3次，滴加正常羊血清室温1h，甩干，按照实验设计一抗为兔抗GS（1∶1600）/鼠抗GFAP（1∶1000）， 4℃过夜。PBS洗3次，滴加相应二抗分别是羊抗小鼠羊抗兔IgGFITC（1∶200）/ IgGCy3（1∶200），室温暗盒中孵育1h，PBS洗3次，封片，共聚焦激光显微镜（Olympus FV1000）读片记录。
1.2.2免疫印迹法定量分析GFAP表达
将相应时间点已分装的大鼠视网膜蛋白提取液取出，加入5×上样缓冲液，95℃变性5min，冰上，按说明书配制60g/L分离胶和50g/L浓缩胶，60V 30min后改90V 90min，按照说明取胶，半干转膜仪15mA 170min将蛋白转至PVDF膜上，取膜，50g/L脱脂牛奶封闭1h，TBST洗3次，每次15min，一抗为鼠抗nestin（1∶50000），4℃摇床过夜，TBST 15min×3，辣根过氧化酶的羊抗鼠IgG二抗室温1h，TBST 15min×3，按试剂盒（美国Amsharm公司产品）说明配制发光剂，将PVDF膜没入其中约5min，取出保鲜膜包好。备好显影液和定影液，X片曝光，将PVDF膜置蛋白洗脱液中15min，取出，重复上述步骤，一抗改为鼠抗βactin。扫描仪扫描底片，参考Xue等[3]方法进行半定量分析。
统计学处理：所有数据以±s表示，应用配对t检验，SPSS11.5统计软件进行统计学分析，以P≤0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1眼压测量结果
术前双眼眼压测量结果表明双眼眼压差别无显著性。正常眼与不同时间点假手术眼眼压差别无显著性，各时间点假手术眼眼压之间差别也无显著性。正常眼和假手术眼的眼压基数为(17.57±0.42) mmHg。术后2h术眼眼压迅速升至(26.77±1.68)mmHg，持续上升至术后1d时达到最高值(27.10±1.27)mmHg，比基础眼压高出0.55倍。随后术眼眼压渐渐有所下降，至术后3wk时，术眼眼压为(23.92±1.85)mmHg，与假手术眼眼压差别仍有显著性。在整个实验过程中，手术显微镜下观察眼部其他组织包括角膜、晶状体、虹膜等未出现结构损害。
2.2 GFAP在Müller细胞上的诱导表达
视网膜矢状位上，正常视网膜中GFAP阳性染色主要位于神经节细胞层的星形胶质细胞上，Müller细胞不表达GFAP。术后2h，术眼GFAP的表达方式即出现了改变，GFAP阳性纤维增多，在视网膜内侧呈栅栏状排列，这些GFAP阳性纤维同时有GS染色，说明在眼压升高后，Müller细胞上出现了GFAP的表达。术后1d和术后3d，术眼GFAP的表达出现显著增加。术后1wk，术眼GFAP的表达达到高峰并一直持续到术后3wk。术后，随病情进展GFAP在Müller细胞上的诱导表达不仅数量上增加，在强度上亦有所增加。这些GFAP阳性细胞纤维贯穿视网膜全层，同时有GS染色。GFAP在Müller细胞上的表达仅仅出现在胞质，特别是在足板的部位，在胞核无GFAP阳性表达。同时我们也发现不仅在手术眼GFAP表达增加，在术后2h～术后3d假手术对照眼GFAP的表达也出现一定程度的增加，增加的程度极轻，出现极少数贯穿视网膜全层的GFAP阳性细胞。术后1wk假手术对照眼的GFAP表达即恢复到正常水平。从前面的研究我们看出GFAP在Müller细胞上的诱导表达基本在术后1wk达到高峰，到术后3wk一直保持在较高水平，而假手术组在术后1wk基本恢复到正常水平。因此，我们选择术后1wk进行视网膜铺片免疫组织化学研究。正常大鼠视网膜表达GFAP的星形胶质细胞位于视网膜GCL和NFL，构成比较规则的网状结构，从这里我们更清晰地看到Müller细胞的足板不表达GFAP，在视网膜铺片中看不到Müller细胞的全貌，仅能看到内侧的足板，位于星形胶质细胞纤维构成的网状结构中，呈点状分布。在Müller细胞足板和星形胶质细胞上未检测到GFAP的表达。术后1wk，GFAP在星形胶质细胞上的表达相对稳定，同时我们清晰地看到Müller细胞的足板出现GFAP的表达。
2.3 Western blotting结果
结果显示GFAP为一分子质量约51kDa的单一蛋白条带。与免疫组织化学结果相符合，术后2h术眼GFAP蛋白量改变不显著，直到术后3d，GFAP蛋白量的改变出现显著性差异，与假手术组相比增加至1.44±0.16倍，术后1wk增加至1.58±0.15倍，至术后3wk一直保持在较高水平。
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