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2结果
2.1植片存活时间
所有移植眼术后早期均见角膜轻度水肿、混浊，随时间延长，渐趋加重，出现明显的角膜植片水肿、混浊以及新生血管，最终发生排斥反应。根据计分标准，移植模型组植片存活时间8～13（平均10.2±1.9）d。而使用抗TNFα mAb治疗后的移植治疗组临床表现加重，时间延迟，植片存活时间为11～17（13.8±2.2）d，较移植模型组明显延长（t=2.908，P<0.01）。
2.2组织病理学观察
正常大鼠角膜各层次结构清晰规整（图1A）。术后7d移植模型组大鼠角膜增厚明显，炎性细胞及新生血管丰富，几乎达角膜全层（图1B）；而移植治疗组角膜仅轻度增厚，在浅基质层可见少量炎性细胞浸润及少量新生血管（图1C）。当发生排斥反应时，两组则均见角膜显著增厚，全层弥漫散在炎性细胞，上皮呈微囊样隆起，二者无明显区别（图1D，E）。
2.3血清TNFα浓度
正常对照组TNFα浓度为32.8±5.9ng/L角膜移植手术后，各组大鼠外周血TNFα水平均呈上升趋势。移植模型组大鼠术后3，7d以及排斥反应时TNFα水平均明显高于正常组（P<0.05）。而使用抗TNF抗体治疗后，TNFα水平上升时间延迟，术后3d时TNFα水平与正常组相当，术后7d时尽管其水平明显高于正常大鼠（P<0.05），但仍低于移植模型组。而当发生移植排斥反应时，两组水平也均明显高于对照组，但二者之间差异已无显著性（表1）。表1穿透性角膜移植大鼠外周血清TNFα浓度（略）
3讨论
肿瘤坏死因子因能使肿瘤出血坏死而得名，但它有广泛的生物学活性，参与了包括器官移植排斥反应等在内的许多病理、生理过程。早在1987年，Maury等[4]就观察到肾移植患者急性排斥期外周血中TNFα水平升高。随后Imagawa等[5]对肝脏移植患者的术后反应进行了研究，发现排斥反应期间血浆TNFα浓度平均为941±83ng/L，明显高于病情稳定者240±6ng/L，提出可以通过监测术后外周血TNFα水平来预测排斥反应的发生和预后。徐秀红等[6]采用酶联免疫吸附法动态监测了52例患者肾脏移植前后血清TNFα的水平变化。结果发现31例患者术后1mo内发生了急性排斥反应，在典型症状出现及血肌酐升高前1～3d，血清TNFα就已有升高，峰值出现在抗排斥治疗的当日。我们认为对肾移植受者外周血TNFα进行检测，可在一定程度上反映肾移植受者的免疫反应状态，并为排斥反应的监测和诊断提供了客观依据。Pleyer等[7]以小鼠为模型检测了角膜移植术后外周血TNFα含量的变化，结果显示正常对照组外周血TNFα平均浓度为41±12ng/L，未排斥组为54±16ng/L，差异无显著性，而排斥组为98±16ng/L，与以上两组相比明显升高，差异有显著性，且这一浓度升高在临床诊断排斥反应之前即出现。王艳等[8,9]以健康新西兰白兔为受体，新鲜鸡角膜为供体进行角膜移植后，发现正常兔血清和房水中均可检测到少量的TNFα，浓度分别为70±17ng/L和31±17ng/L，术后早期房水及外周血中TNFα含量即升高，至排斥反应前达最高水平，在观察期（28d）内维持高水平。血、房水TNFα含量变化呈密切正相关。排斥反应发生时，房水内可见较多淋巴细胞和巨噬细胞。从而认为血和房水中的TNFα是角膜移植免疫排斥反应发生的重要因素之一，术后监测外周血TNFα含量变化可了解局部免疫反应的程度并预测排斥反应的发生。在本实验中我们发现，术后3d角膜移植大鼠血清TNFα水平即已高于正常对照组，术后7d其水平进一步升高。随着血清TNFα水平的升高，移植角膜逐渐出现新生血管增多、角膜水肿、混浊加重等更为明显的免疫排斥反应表现，并且在临床诊断排斥反应出现之前，血清TNFα即已出现明显升高。结合其他研究结果，可以认为TNFα参与了角膜移植排斥反应，而术后动态检测血清TNFα水平有助于预测、早期诊断排斥反应的发生。TNFα参与器官移植排斥反应的一个十分重要的机制，正是在排斥反应早期上调了移植器官抗原的表达[10,11]。此外，TNFα可以直接激活T，B淋巴细胞和NK细胞，并且诱发IL1，IL6的合成，上调IL2受体的表达。TNFα在排斥反应中发挥重要作用的原因还在于由移植物局部激活的浸润细胞产生的TNFα，通过诱生上调IL8[12]或者直接上调血管内皮细胞上的粘附分子，进而促使单核巨噬细胞、淋巴细胞以及中性粒细胞等向移植物游走、粘附血管壁，并在移植物局部聚集。另外TNFα可通过使f－肌动蛋白丝发生断裂增加角膜内皮细胞通透性[13]，以及通过促进内皮细胞分化或通过炎症反应间接诱导新生血管。以上诸多因素驱动了同种异体抗原的免疫反应，使角膜炎症反应逐渐加重，新生血管渐趋弥散，最后细胞毒性T细胞进入，造成供体细胞裂解或凋亡而使植片破坏。TNFα拮抗剂有抗TNFα抗体（嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体等）、抗TNFα受体抗体、可溶性TNFα受体及TNF受体Fc融合蛋白等几类，其中抗TNF抗体是目前应用最广泛的一类，已用于G菌感染和脓毒性休克的治疗、自身免疫性疾病的治疗、异体移植排斥反应以及急性移植物抗宿主反应疾病的治疗等[14]。Imagawa等[15]研究发现对正位心脏移植的大鼠腹腔注射或静脉注射抗TNFα抗体，可使移植物存活时间由11.0±0.4d延长至16.0±2.7d（P<0.05）和15.0±1.4d（P<0.01）。另有许多学者亦得出了类似的结果，从而说明抗TNFα抗体可以抑制移植排斥反应的发生。
我们应用抗TNFα抗体对部分角膜移植大鼠进行治疗，结果发现与未治疗组相比，术后早期角膜炎症反应较轻，外周血清中TNFα水平较低，TNFα上升时间后延，最终使植片存活时间由10.2±1.9d延长到13.8±2.2 d。该结果无疑从另一方面证明TNFα参与了角膜移植排斥反应。而抗TNFαmAb的作用可能在于一方面通过与TNFα的特异性结合阻断TNFα生物学效应的发挥，另一方面也促进机体对TNFα的免疫清除过程，从而部分地抑制角膜移植排斥反应的发生，延长植片存活时间。
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