|
1.2方法
取人新鲜胎盘用Trizol试剂抽提总RNA，经RTPCR制备sFIt1基因。针对人sFIt1基因胞外第2～3免疫球蛋白样区域的编码序列设计引物，上游5’引入BamH 1酶切位点，下游5’引入Sal 1酶切位点及终止密码子。引物设计如下：sFIt1（23）上游序列：5’TAGGATCCATGGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAG3；下游序列：5’TAGTCGACTATTACAGCTCGTCCTTTTTTCGATGTTTCAC
AGTGA3。扩增参数如下：94℃变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，68℃聚合延伸反应30s，循环30次，于72℃聚合延伸反应8min，于4℃保存。将PCR扩增产物以10g/L的琼脂糖凝胶电泳回收、纯化。PCR所得纯化产物插入经BamH 1和Xho 1双酶切的真核表达质粒pcDNA 3.1，以T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞，并在氨苄青霉素抗性LB平板上进行筛选。挑选阳性克隆的质粒用限制性内切酶BamH 1和Sal 1双酶切鉴定，10g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线下检测获得的DNA片段。采用分光光度计测定重组质粒在260nm和280nm的吸光度值，计算质粒的含量及纯度，将其稀释为浓度1g/L，20℃保存待用。本实验分为CMD磁颗粒（CMDMAG）组、PEI磁颗粒(PEIMAG)组、单纯PEI组及未转染对照组。按照磁颗粒与质粒质量比为0.4，将CMD磁颗粒、PEI磁颗粒分别与3μg质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)在无血清1640培养液溶液中混合，室温静置5min,得到DNA/CMDMAG和DNA/PEIMAG复合物；再按照N/P比（聚合物中的氨基基团与DNA中磷酸基团的摩尔比）10,15,20,25,30分别将PEI与上述2种复合物及3μg质粒混合，总体积均以无血清RPMI 1640培养液补足至400μL。涡旋，室温静置15min，获得PEI/DNA/CMDMAG，PEI/DNA/PEIMAG,PEI/DNA 3组转染复合物，每组3份。取第3～5代处于对数生长期的HUVEC，以细胞数1.5×105个每孔接种到六孔板，培养至细胞融合密度达80％。吸弃培养液，每孔加入无血清1640培养液600μL，再分别加入上述制备好的PEI/DNA/CMDMAG，PEI/DNA/PEIMAG,PEI/DNA转染复合物，混匀。CMD磁颗粒组、PEI磁颗粒组细胞置于0.5T磁板上，培养箱中培养20min；单纯PEI组于培养箱中培养4h。分别吸去转染复合物液体，加入适量含100mL/L胎牛血清（FBS）的1640培养液，继续培养；未转染对照组直接更换新鲜培养液后继续培养。同时以上述3种方法对HUVEC进行空载体pcDNA3.1EGFP的转染。转染1d后通过荧光显微镜及流式细胞仪检测报告基因GFP的表达量以反映载体的转染效率；通过RTPCR法和Western印迹法检测感染细胞中sFIt1（23）的表达。
1.2.1 RTPCR
收集转染细胞，以Trizol试剂提取细胞总RNA，经过反转录后，以转染细胞cDNA为模板，用目的基因引物扩增，PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃聚合延伸反应30s，共循环25次，再次72℃聚合延伸反应7min，于4℃保存。以人GAPDH为内参，引物设计如下：上游5’GACCCCTTCATTGACCTCAACTACA3’，下游5’CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3’，长890bp。反应产物于10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成相系统拍照。
1.2.2 Western blotting
用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解收集到的各组细胞，离心，留上清液充分变性。加入稀释5倍的上样缓冲液，取适量，采用BCA法测定蛋白样本浓度，计算上样体积，余80℃保存。取适量上述蛋白上样进行SDS凝胶电泳：配制100g/L的分离胶、50g/L的浓缩胶，上样后60V恒压电泳，待溴酚蓝至分离胶与浓缩胶交界处，换恒压120V电泳使溴酚蓝电泳至分离胶最底部。恒压110V 2h将分离胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上。膜用50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭1h，抗人sFIt1 mAb（1∶500） 4℃过夜；次日辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000）室温孵育2h。ECL显色系统压片，洗片后扫描。以βactin为内参。对扫描结果进行光密度分析。
1.2.3 HUVEC生长的检测
在96孔板上每孔接种5000个细胞，37℃，50mL/L CO2培养至80％融合。各实验组按前述条件分别转染质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)后加入含100mL/L血清的RPMI 1640培养液继续培养24～48h。每天各组取4个培养孔（另有相同数目的无细胞空白对照孔）加MTT 20μL，孵育4h后加DMSO显色。在酶标仪上测定各孔490nm/630nm吸光度值，并计算细胞的相对增殖百分率RGR(%)。
1.2.4细胞凋亡的观察
前述各组转染质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)后的细胞培养24h后吸弃培养液，加入无水乙醇0.5mL固定10min；去乙醇，PBS冲洗2次，每次3min，吸尽液体；加入Hoechst染色液0.5mL，轻柔摇动5min；去染色液，PBS冲洗2次，每次3min，吸尽液体；倒置相差荧光显微镜下观察正常细胞与凋亡细胞的比例。
统计学分析：采用SPSS 11.0统计学软件进行分析，数据资料用±s表示，各组间结果比较运用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 RTPCR扩增sFIt1(23)基因片段
重组质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)经BamH 1和Sal 1双酶切、扩增，酶切产物在琼脂糖凝胶上的电泳时出现条带，大小为633bp，与理论预计相符（图1）。
2.2重组质粒的酶切和测序鉴定
重组质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)经BamH 1和Sal 1酶切后于10g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线下可见载体片段和sFIt1(23)片段,长度分别为5.4kb和633bp（图2），与理论预计一致。sFIt1测序结果与Gene bank中标准Flt1序列也一致。经紫外分光光度计测定，质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)的A260/A280=HUVEC1.892，浓度为926mg/L，质粒pcDNA3.1EGFP的A260/A280=1.919，浓度为375mg/L。说明抽提得到的质粒DNA浓度较高，可以用于体外HUVEC的转染实验。
上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
