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2.3转染HUVEC后sFIt1(23)的表达
转染后24h经倒置相差荧光显微镜观察可见黑色背景下转染了EGFP的各组细胞均有不同程度的绿色荧光点，勾勒出明显的细胞形态特征（图3）。流式细胞仪检测结果显示，各组在N/P比为20时EGFP基因的转染率最高；CMD磁颗粒组在各N/P比转染率明显高于其他组，当N/P=20转染率平均为45％（图4）。RTPCR和Western blotting结果均显示，质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)转染各组HUVEC后均有sFIt1(23) mRNA和蛋白不同程度的表达，不仅证实了sFIt1(23)能被纳米磁颗粒介导转染到HUVEC，且提示我们CMD纳米磁颗粒作为载体获得的转染率明显高于PEI磁颗粒（图5A，B）。
2.4细胞生长曲线
与未转染对照组比较，CMD磁颗粒组细胞增殖与对照组差异无统计学意义，PEI磁颗粒组、PEI组细胞增殖能力均明显降低（图6）。各组细胞相对增殖百分率表明，PEI/DNA/CMDMAG复合物对HUVEC毒性较小，基本不影响细胞的生长；PEI/DNA/PEIMAG复合物、PEI/DNA复合物对HUVEC毒性较大，不同程度的影响细胞生长（图7）。
2.5凋亡HUVEC的观察
经Hoechst染色后细胞核呈致密浓染，甚至碎裂；正常细胞的核则呈均匀淡蓝染。与未转染对照组(图8A)比较，CMD磁颗粒组（图8D）凋亡细胞数仅约为5％；PEI磁颗粒组（图8C）凋亡细胞百分数约为20％～30％；PEI组（图8B）约为50％。
3讨论
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是新生血管形成过程中的重要因素之一[2]。最近的研究发现，VEGF小干扰RNA的转染对视网膜新生血管的形成具有明显的抑制作用[3]；而在Pechan等[4]的研究中，VEGF受体1基因片段也可抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管性病变的发展。可溶性血管内皮受体1（sFIt1）是VEGF受体1（FIt1）mRNA胞外区段经剪接获得的产物，具有7个免疫球蛋白样（Iglike loop）区域，其中第2，3 loop为与VEGF结合的主要功能区。sFIt1受体可竞争性抑制VEGF与其主要功能受体VEGFR 2（KDR/Flk）的结合，从而阻断VEGF的生物学功能。因此，我们构建了携带人sFIt1受体第2～3loop基因的真核表达质粒pcDNA3.1/sFIt1(23)。经过酶切及电泳鉴定，质粒所携带的sFIt1(23)序列与Gene bank中标准Flt1序列一致。在眼部新生血管的基因治疗过程中，一般是选择腺病毒及其相关病毒为基因载体。但是此类载体存在强免疫原性、表达不稳定、使用不安全等缺点。为此，寻求更优良的基因载体已经成为共识。非病毒型载体阳离子复合物PEI在体外实验中具有较高转染效率[1]，但由于PEI表面所带正电荷形成的强渗透作用[5]，它所引起的细胞毒性是不能忽视的。且PEI/DNA复合物溶解性差、细胞毒性大，在传递过程中易沉淀[6]，缺乏靶向性。磁转染法是以不同的磁性纳米颗粒作为基因载体，与阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）、质粒DNA形成复合物，再在外界恒定或变化磁场的作用下进行的体内或体外的基因转染过程。它克服了无外界磁场作用下PEI/DNA复合物转染缺乏靶向性的缺限，使DNA更多地富集到细胞表面，是一种低毒、高效、应用广泛的基因转染方法[7]。通过磁转染，携带目的基因的质粒DNA和人工合成的小干扰RNA(siRNA)等都可以在较短的时间内高效地转染到细胞中去[8]。据Scherer等[9]报道，与脂质体和病毒载体转染相比，对HUVEC短暂的15min的磁转染过程在得到更高的转染效率的同时也大大的降低了细胞毒性。Lee等[10]以纳米磁颗粒为载体携带EGFP基因转染小鼠胚胎干细胞获得了45％的转染效率，而脂质体作载体的转染率仅为15％。理想的基因靶向传递技术应保护治疗基因不被细胞间质的核酸酶降解、使治疗基因穿透原生质膜进入到靶向细胞核、对组织和细胞没有毒害作用。因此，在提高转染率和减低毒性之间需要找到最佳的平衡点。由于纳米磁颗粒对眼部结构可能具有潜在的毒性，目前还未见有关磁转染在眼科方面应用的报道。人们通过引入亲水基团、增加接枝数等方法改变纳米磁颗粒表面结构使其保持高转染效率而使毒性降低，为纳米磁颗粒作载体对眼底新生血管性疾病进行基因治疗提供了很大的研究空间。CMD磁颗粒就是通过络合作用在传统的磁颗粒表面修饰上羧甲基化葡聚糖而形成的一种新型纳米材料。从理论上来说，由于络合作用改变了磁颗粒的分子结构，CMD磁颗粒具有分子量小、物理及化学性质稳定、在溶液中可保持均匀悬浮、不易受体内各种酶攻击等优点。另外这种磁颗粒更容易穿过细胞膜，将目的基因带入细胞内部。目前对此种磁颗粒转染细胞的研究刚刚开展，因此为了更客观地了解这种新的纳米材料基因载体的转染效率及对细胞产生的毒性，我们分别以CMD磁颗粒和目前最常用的PEI磁颗粒制备成PEI/DNA/CMDMAG复合物和PEI/DNA/PEIMAG复合物，在相同外界磁场条件下对HUVEC进行目的基因片段sFIt1(23)和绿色荧光蛋白报告基因（GFP）的转染。通过倒置荧光显微镜对绿色荧光的定性观察和流式细胞仪对绿色荧光蛋白（GFP）表达的定量检测，结果证实CMD磁颗粒组的EGFP表达率是PEI磁颗粒组的2倍左右，是单纯PEI转染组的4～5倍。而RTPCR和Western blot法的检测结果也显示，以CMD磁颗粒作为载体转染HUVEC较单纯PEI和PEI磁颗粒可以获得更高效、稳定的目的基因片段sFIt1(23)的表达。在进行磁转染的过程中，N/P是需要考虑的重要因素。Godbey等曾报道，随着N/P的增加，转染率增加，相应的细胞毒性也增加[7]；当N/P增加到一定值时转染率下降。Chen等[11]发现随着N/P的增高，细胞的存活率逐渐下降。N/P过大会使转染复合物呈现纤维样不规则排列,影响细胞对DNA的摄取[12]，同时也会造成对细胞本身的伤害。本实验中各组在N/P为20时转染率达到最高，而在N/P>20时转染率均开始下降；N/P与其产生的细胞毒性成正比。凋亡是细胞死亡的另一种形式。纳米磁颗粒作为外源性物质在转染过程中可能会引发细胞的凋亡，因此细胞凋亡率也是衡量磁颗粒毒性的指标之一。CMD磁颗粒组在转染后24h只有5％的HUVEC发生凋亡；而与之相比，PEI磁颗粒组约有20％～30％细胞凋亡，单纯PEI组则为50％左右。同时，我们也注意到各组凋亡细胞的百分数随N/P的加大而逐渐增加。
大量的体外试验都证明磁转染方法是一种安全、高效、成熟的基因转染方法，因此它正越来越多地被用于活体内和疾病动物模型的基因转染。体内PH值、各种酶的作用及疾病状态下的低营养状况都是体内基因转染所要面临的挑战[9]，磁转染方法的优越性让它有可能成为体内局部靶向给药和基因治疗的最佳选择。不同组织和细胞对于相同基因载体适应性是不同的，为此人们才不断地研制出不同的纳米磁颗粒载体。不久前Bhattarai等[13]以氯化物修饰的壳聚糖纳米磁颗粒（Nac6IOPs）介导的体内和体外K562细胞的转染均取得了很高的效率。由于眼部组织结构的特殊性，对眼部进行磁转染和活体眼内进行磁载体介导的基因治疗无疑也对研发新的纳米磁颗粒提出了更高的要求。我们在体外对CMD纳米磁颗粒及其磁转染条件的研究显示CMD纳米磁颗粒可以作为基因载体高效地进行sFIt1受体基因片段的转染，且对HUVEC细胞产生的毒性小、引起细胞的凋亡少，因而为眼底新生血管性疾病的基因治疗过程中载体的选择提供了重要的实验依据。
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