【摘要】  确定静止期结膜眼表重建术后新鲜羊膜上皮在眼表的存活时间及其影响因素，以期探讨羊膜上皮在新鲜羊膜移植重建眼表的相关作用机制。【方法】 选择临床连续病例共２９例。其中复发翼状胬肉８例８只眼，蚕蚀性角膜溃疡８例８只眼，轻中度睑球粘连１３例１３只眼。按常规方法行新鲜羊膜移植，移植后不同时间复诊时进行羊膜表面的印迹细胞学检查，手术前后进行泪液分泌量的测定。 【结果】 翼状胬肉和蚕蚀性角膜溃疡患者、３例陈旧性热烧伤患者泪液分泌试验正常，在这些病例的新鲜羊膜植片表面术后３个月印迹细胞学尚不能找到呈ＰＡＳ阳性的杯状细胞，但术后４月可见。在陈旧性碱烧伤眼中，２／８眼泪液分泌功能正常，在术后２月时可见杯状细胞。另有６眼陈旧性碱烧伤和２眼Ｓｔｅｖｅｎｓ-Ｊｏｎｈｓｏｎ综合征患者泪液分泌减少，在术后２周有６／８眼、１月时有２／８眼可在羊膜植片表面找到杯状细胞。同步的临床观察显示：新鲜羊膜植片术后荧光素染色一直呈阴性，但２周左右则部分少许染色，术后３周以后染色一直呈阴性。【结论】 新鲜羊膜上皮细胞在泪液分泌功能不同和移植床微环境不同的静止期结膜眼表存活的时间不同。在泪液分泌功能正常和移植床微环境良好者可存活３个月左右，在干眼症和化学伤患者中存活时间大大缩短。

   【关键词】  羊膜移植 眼表重建 印迹细胞

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：  【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】  Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｆｒｅｓｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｅａｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｅｃｋ-ｐｏｉｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｓｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｅｘｃｉｓｉｏｎ，ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｍｂｌｅｐｈａｒｏｎ ｌｙｓｉｓ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】  Ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｇｒａｆｔｓ ｉｎ ２１ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｅａｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ （ａｌｌ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅｎ′ｓ ｕｌｃｅｒ， ５ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｙｅ ｂｕｒｎｓ） ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ＰＡＳ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｐｐｅａｒ ｕｐ ｔｏ ３ ｍｏｎｔｈｓ ｂｕｔ ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４ ｍｏｎｔｈｓ ｉｎ １９ ｅｙｅｓ ｏｆ ｔｈｅｍ，ｂｕｔ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａｎｏｔｈｅｒ ２ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｕｒｎｓ ａｔ ２ ｍｏｎｔｈｓ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ． Ｏｎ ｔｈｏｓｅ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｄｒｙ ｅｙｅ，６ ｏｆ ８ ｅｙｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｆｏｕｎｄ ｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｔ ２ ｗｅｅｋｓ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ， ｂｕｔ ａｎｏｔｈｅｒ ２ ｅｙｅｓ ａｔ １ ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｒｅｓｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｇｒａｆｔｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｅａｒ ｆｉｌｍ， ｂｕｔ ａ ｆｅｗ ｓｐｏｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ２ｎｄ ｗｅｅｋ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｏｓｅ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｄｒｙ ｅｙｅ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】  Ｆｒｅｓｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｋｅｅｐ ａｌｉｖｅ ｕｐ ｔｏ ３ ｍｏｎｔｈｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｅａｒ ｆｉｌｍ ａｎｄ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｍａｙｂｅ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｏｎ ｔｈａｔ ｋｉｎｄ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｄｒｙ ｅｙｅ ｏｒ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．

　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｙｔｏｌｏｇｙ； ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

　　自１９９５年Ｔｓｅｎｇ等发表了羊膜移植重建结膜眼表以来，羊膜移植正成为当今眼表重建的一大热点［１］。目前使用的基本上是保存羊膜。其后，我们报告利用新鲜羊膜移植成功地重建眼表，临床结果提示新鲜羊膜可能比保存羊膜更好，也没有发现有些学者担心可能会出现的免疫排斥现象［２］。最近的研究也证明，新鲜羊膜移植入眼表、眼前房等均不发生免疫排斥［３］。同时研究也发现，保存的羊膜其上皮细胞已经死亡，生物学活性成分也下降了将近一半，羊膜中的生物活性物质主要来源于羊膜的上皮细胞［４］。因此，越来越多的研究正立足于利用活的羊膜上皮来重建眼表，甚至有研究者发现羊膜上皮中居然表达干细胞标志［５］。但移植后的新鲜羊膜上皮到底在眼表能存活多长时间尚无相关文献报告。由于新鲜羊膜移植后的存活时间直接关系到新鲜羊膜和保存羊膜的效果差异，所以本文通过印迹细胞学的方法来初步确定新鲜羊膜上皮移植在静止结膜眼表后的存活时间，并探讨其影响因素，以期分析羊膜上皮在眼表重建中的相关作用机制。

　　１ 材料与方法

　　１．１  病例选择

　　对１９９８年１１月至２００１年６月在我中心角膜病科完成的大植片新鲜羊膜移植共２９例进行印迹细胞学研究。其中复发性翼状胬肉８例８只眼，蚕蚀性角膜溃疡８例８只眼，因Ｓｔｅｖｅｎｓ-Ｊｏｎｈｓｏｎ综合征（２眼）、陈旧性眼化学伤（８眼）和热烧伤（３眼）导致的睑球粘连１３例１３眼。对所有患者在手术前后进行泪液分泌试验检查（无表麻，Ｓｃｈｉｍｅｒ′ｓ Ｔｅｓｔ Ｉ）。

　　１．２  新鲜羊膜的取材与制备

　　选择健康青年产妇剖腹产获得的胎盘在无菌条件下立即用含５０ μｇ／ｍＬ青霉素、５０ μｇ／ｍＬ链霉素和２．５ μｇ／ｍＬ二性霉素Ｂ的生理盐水冲洗干净血迹，再将羊膜从胎盘的绒毛膜上钝性分离后，平铺于手术粘贴纸巾的纸片上（上皮面向上）。然后将附有羊膜的纸片剪成７ ｃｍ × ８ ｃｍ大小并置于－４ ℃ ＤＭＥＭ溶液中保存， ２４ ｈ内备用。

　　１．３  手术方法

　　翼状胬肉和蚕蚀性角膜溃疡：先清理并切除病灶组织，前者切除增殖的球结膜下组织和侵入角膜的纤维血管组织；后者先切除病变角膜，并进行局部板层角膜移植，再切除病灶邻近球结膜组织４  ｍｍ × ６ ｍｍ。最后将同等大小的新鲜羊膜移植到切除结膜后暴露的巩膜创面，并予以８-０可吸收缝线或１０-０尼龙线缝合固定。睑球粘连：先充分分离睑球粘连并切除球结膜下增殖组织，尽量松解粘连组织，并使眼球能自由转动。再将残存的球结膜后退，最后将新鲜羊膜移植于彻底止血后的巩膜创面并予以良好的缝合固定。术后处理：术后常规连续包扎患眼２ ｄ，然后给予开放点眼。白天使用复方妥布霉素（含２．５５ ｍｍｏｌ／Ｌ地塞米松，每天４次，中山眼科中心制剂室）点眼预防感染和抑制炎症，使用１．２２ ｎｍｏｌ／Ｌ ＦＫ-５０６抑制角膜移植排斥和蚕蚀性角膜溃疡复发，使用１．６７ μｍｏｌ／Ｌ透明质酸钠滴眼液（每天６次，日本参天制药）润滑眼表和促进眼表上皮生长，晚上涂０．３ ｍｇ／ｇ妥布霉素眼膏（中山眼科中心制剂室）预防感染。

　　１．４  印迹细胞学

　　对上述病例分别在术后第１、２周和第１、２、３、４月时进行羊膜植片表面的印迹细胞学检查。即：先表面麻醉患眼，然后用经过裁减和紫外线消毒的乙酸纤维素纸按压羊膜植片中央区的的表面取得羊膜表层细胞。取材前用棉签吸干泪液，取材时注意乙酸纤维素纸的粗糙面朝下，以便使取材纸和细胞良好的接触，从而取得足够的眼表（羊膜表面）细胞。然后将带有细胞的乙酸纤维素纸用９５％酒精固１０ ｍｉｎ以上，继而用蒸馏水冲洗５ ｍｉｎ和２１．９４ μｍｏｌ／Ｌ高碘酸漂洗３ ～ ５ ｍｉｎ，再次用蒸馏水冲洗、Ｓｃｈｉｆｆｅｒ′ｓ液浸泡５ ｍｉｎ自来水水浴，最后进行苏木素染色１ ｍｉｎ和自来水冲洗、无水酒精脱水和蒸馏水冲洗、自然烘干、封片和显微镜下观察、照像，等等。

　　２ 结 果

　　翼状胬肉患者（８眼）、蚕蚀性角膜溃疡患者（８眼）、３例陈旧性热烧伤患者泪液分泌试验正常（ ＞ １０ ｍｍ），在这些病例的新鲜羊膜植片表面术后３个月印迹细胞学尚不能找到呈ＰＡＳ阳性的杯状细胞，但术后４月时则出现。在陈旧性碱烧伤眼中，２／８眼泪液分泌功能正常，在术后２月时可见杯状细胞，这２例患者术后检查时眼表表现为睑球粘连呈进行性发展（图１，２）。另有６眼陈旧性碱烧伤和２眼Ｓｔｅｖｅｎｓ-Ｊｏｎｈｓｏｎ综合征患者泪液分泌试验呈干眼状态（ ＜ ５ ｍｍ），在术后２周有６／８眼、１月时有２／８眼可在羊膜植片表面找到杯状细胞（图３）。

　　同步的临床观察显示：部分羊膜植片特别是在陈旧性化学伤者术后４ ～ ５ ｄ呈灰白色轻度水肿，以后逐渐变透明、厚度正常。新鲜羊膜植片术后荧光素染色一直呈阴性，但２周左右则部分少许染色，从＋ ～ ＋＋不等。术后３周以后染色一直呈阴性。所有患者在手术前后的泪液分泌实验结果没有明显变化。

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