作者：郭斌，王应利，惠延年，王雨生，马吉献

    【摘要】  目的：用免疫磁珠法原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC)，观察共培养Müller细胞对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响。

    方法：采用免疫磁珠的细胞分选法分离大鼠视网膜微血管内皮细胞，在条件培养基中培养生长，采用第Ⅷ因子抗体免疫组化染色方法鉴定细胞，采用流式细胞术和台盼兰染色分析传代中的微血管内皮细胞纯度以及细胞活性。传统的方法培养并鉴定Müller细胞。采用不同孔径微孔滤膜培养小室，进行大鼠视网膜微血管内皮细胞与Müller细胞分离共培养，对照组培养环境中无Müller细胞。以细胞曲线描绘反映细胞增生，并用流式细胞仪测定细胞周期。相差显微镜下计算穿过微孔滤膜迁移贴附于背面的内皮细胞数量。

    结果：通过磁珠分离方法获得了纯度为97.13%大鼠视网膜微血管内皮细胞，细胞活力达92％，第Ⅷ因子抗体染色呈阳性。与Müller细胞共培养的RMEC可早于正常培养2～3d进入生长平台期。RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相对减少。S、G2和G1期百分比，在共培养组24h分别为44.0％，11.2％和44.8％，48h分别为42.3％，10.9％和46.8％；对照培养组24h分别为41.3％，4.9％和53.8％，48h分别为40.1％，4.7％和55.2％。迁移的细胞数增加，共培养6h移行至膜下的内皮细胞数12.2±2.5个，12h为51.7±23.4个，对照培养6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个，12h为14.7±7.0个，6h和12h两组内皮细胞数差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

    结论：免疫磁珠细胞分选方法可以获得高纯度的大鼠视网膜微血管内皮细胞，且对细胞活力无影响。Müller细胞可以促进视网膜内皮细胞的迁移，促进该细胞的增生。

    【关键词】  视网膜

    0引言

    视网膜血管形成包括血管发生（vasculoge- nesis）和血管生成（angiogenesis）形式，前者是视网膜形态功能发育过程中的重要环节[1,2]，后者与许多眼底病发病相关 [3,4]：如早产儿视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变以及视网膜静脉阻塞等。视网膜微血管内皮细胞（RMEC）是组成视网膜血管的结构单位之一，视网膜血管生成与该细胞所处状态有关，如细胞增生、移行、分化等。从细胞水平来分析视网膜血管生成内环境，可以发现RMEC受到多种周围细胞的调节，其中之一即是Müller细胞[5]。视网膜中Müller细胞是视网膜内最主要的大胶质细胞，它贯穿于视网膜各层，在调节营养神经元、排除代谢产物、维持血管稳态等方面起到重要作用[5]。目前多数文献报道了正常条件下Müller细胞在RMEC分化和紧密连接通透性方面的作用[6-8]，而无涉及对于RMEC增生和迁移方面的影响。为避免细胞种属间的干扰，我们原代培养Wistar大鼠的RMEC和Müller细胞，采用微孔滤膜培养小室建立三维共培养模型，研究在非接触情况下，Müller细胞对RMEC增生和迁移方面的影响。为进一步研究Müller细胞分泌作用对RMEC的部分生物学特性的影响奠定基础。

    1材料和方法

    1.1材料  100mL/L 胎牛血清〔（Fetal Bovine Serum, FBS），杭州四季青〕的DMEM（Gibco），100g/L链霉素，100kU/L青霉素，55kU/L肝素（Sigma），75g/L内皮生长添加剂〔（endothelial cell growth supplement, ECGS），Sigma〕，小鼠IgG免疫磁珠（直径4.5±0.2μm，Dynal Biotech）100 μL，用无血清的DMEM清洗3遍，然后加入小鼠抗大鼠PECAM-1 mAb（1g/L，Chemicon）10μL 4℃包被过夜。包被后的磁珠用含有100mL/L FBS清洗3～6遍，悬浮磁珠。

    1.2方法

    1.2.1 RMEC的培养和鉴定  RMEC分离培养采用改良Hewitt等方法[9-12] ，选择15只Wistar大鼠（由第四军医大学实验动物中心提供），体质量250～300g，屈光介质清晰，眼底无异常。乙醚麻醉处死大鼠，迅速取出眼球，置于含有青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)中浸泡5min取出，解剖显微镜（Stemi V6, Zeiss）下无菌操作取出30只视网膜。将视网膜收集在一起，用PBS冲洗，再置于培养皿中剪成小块，再置于1g/L的Ⅰ型胶原酶（Sigma，采用无血清的DMEM配制）5mL中37℃消化30min，过双层的53μm尼龙筛网（上海德华金属网带有限公司），收集滤液离心（400g）10min，弃上清，使用含有100mL/L FBS中和，吹散细胞，400g离心10min，弃上清液。加入100mL/L FBS 1.5mL吹打使细胞悬浮，加入抗体包被的免疫磁珠，4℃孵育30min，紧密结合后，置于磁珠分离装置（MCP-1, Dynal）上用100mL/L FBS洗涤结合磁珠的细胞6次，将细胞接种于明胶包被的培养板中，加入培养液。细胞培养箱（Heraeus）环境为37℃、50mL/L CO2、950mL/L 空气，细胞扩增传代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)（1∶1）混合消化液(TE)。 将已消毒的5mm盖玻片置于30mm培养皿中，按1×108/L细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞贴壁牢固后，PBS清洗爬片，40g/L多聚甲醛固定20min，PBS清洗，30mL/L H2O2孵育 15min。PBS清洗，封闭血清孵育20min，兔抗大鼠Ⅷ因子抗体（Zymed）在37℃孵育（湿盒）180min，阴性对照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入辣根过氧化物酶标记的多聚物连接兔IgG工作液37℃孵育（湿盒）30min。PBS清洗标本，DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约2～5 min，立体显微镜（Leica）观察照相。显色棕黄色为阳性表达。第6代RMEC使用含有0.4g/L EDTA的PBS溶液冲洗1次，与1mL细胞分离溶液孵育，分散细胞，细胞再用含有100mL/L FBS清洗，使用含有10mL/L山羊血清的三乙醇胺缓冲盐溶液(triethanolamine-buffered saline, TBS)封闭 20min，后与小鼠抗大鼠PECAM-1抗体在冰盒中孵育30min。阴性对照采用DMEM代替小鼠抗大鼠PECAM-1抗体。孵育后细胞用TBS/10g/L BSA清洗2次，再与FITC-小鼠IgG在冰盒中孵育30 min。染色后细胞使用TBS/10g/L BSA洗涤两次，悬浮于0.5mL TBS/10g/L BSA，使用流式细胞仪（FACS，Becton-Dickinson）分析。取第6代RMEC悬液，以4g/L台盼蓝进行细胞染色，3min内在倒置相差显微镜（Axiovert 25，Zeiss）下计数拒染细胞数，每次至少计数100个细胞，计数3次，按活细胞率=拒染细胞数/（拒染细胞数+染色细胞数）的百分数计算平均细胞存活率。

    1.2.2 Müller细胞培养及鉴定  参考Reichenbach等[13]方法，将出生2d的Wistar新生鼠麻醉处死，取出眼球，剥离视网膜，用PBS冲洗，再置于培养皿中剪成小块，用2.5g/L 胰酶消化，振荡20min，加入100mL/L FBS终止消化，经53μm尼龙筛网，得细胞悬液，离心洗涤后接种于培养板中，加入培养液。培养环境及传代方法同RMEC。细胞爬片标本制作同前。PBS清洗，封闭血清孵育20min，一抗采用兔抗大鼠GFAP（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako），在37℃孵育（湿盒）180min，阴性对照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入FITC-二抗工作液37℃孵育（湿盒）60min。PBS清洗标本，封片，荧光显微镜（Zeiss）观察照相。显示绿色荧光为阳性表达。

    1.2.3 RMEC实验  第5～6代RMEC生长接近70%时，换去血清培养液，加入无血清培养液，继续培养24 h。取第3～4代生长状态良好的Müller细胞，TE消化制成单细胞悬液，细胞密度为1×107/L，接种于微孔孔径0.4μm Millicell（Millipore）或Transwell（Corning）小室内底面（用于增生实验），或接种于微孔孔径8μm Millicell（用于迁移实验），细胞铺满底面80%可用于进一步实验。取第5～6代生长状态良好的RMEC，TE消化制成单细胞悬液，细胞密度为2×107/L，每孔约500μL接种于24孔板(明胶预先包被)，共接种4个24孔板，分成对照组（孔内放入未接种Müller细胞的Millicell小室）和共培养组（孔内放入接种Müller细胞的Millicell小室）。培养液为100mL/L FBS，每隔2d细胞换液1次。每天各组细胞取3～6孔细胞进行计数，并计算均值。共记数10d，以培养时间为横轴，细胞数(对数)为纵轴，描绘曲线。将RMEC用无血清DMEM制成密度为1×108/L细胞悬液，接种2mL于6孔板(明胶预先包被)，培养液为无血清DMEM，分成对照组（孔内放入未接种Müller细胞的Transwell小室）和共培养组（孔内放入接种Müller细胞的Transwell小室）；细胞培养24h和48h后，常规方法消化，收集细胞，PBS洗涤后，加入10g/L RNA酶溶液200μL，37℃水浴15min，加入碘化丙啶(PI，BD公司)，上流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料均经软件收集、贮存和分析。参考孙慧勤等[14]迁移实验方法，将预先接种好Müller细胞的24孔板内放入相应规格的8μm微孔孔径 Millicell小室（12孔），对照组（12孔）在未接种Müller细胞的24孔板内进行相同操作。将RMEC用100 mL/L FBS的DMEM制成密度为1×108/L细胞悬液，接种200μL于Millicell小室内，下方24孔板内加入500μL培养液摇匀，放入孵箱中，6,12 h后取6个Millicell小室，以棉签拭去小室内底面滤膜上的内皮细胞。PBS 洗后将小室置于950mL/L乙醇中固定10min，PBS洗后于高倍镜（×100）下随机计数13个视野内的外底面细胞数。

    图1 微孔滤膜培养小室示意图

    统计学处理：数据以均数±标准差(x ±s)表示，采用Microsoft Excel 2003软件统计数据，进行t检验，P＜0.05表示数值差异具有统计学意义。

    2结果

    2.1大鼠RMEC培养及鉴定  原代RMEC可以结合4～6个磁珠(图2A)，其中以结合4个磁珠的常见，也可以看到结合更多磁珠的细胞条索。RMEC一般在24h内贴壁，48h完全牢固贴壁，72h可见细胞伸展，开始增生，呈现克隆样生长(图2B)，14d左右细胞克隆融合呈铺路石样外观。贴壁后细胞多数呈扁平梭形，也有少数细胞形态不规则，细胞长度约为磁珠直径20～30倍，宽度约为磁珠直径5～10倍。新生的细胞还可以结合培养液中游离的磁珠。细胞经历传代后(图2C)，磁珠可自然脱落，细胞形态较原代更加规则，传代周期缩短至9～12 d。RMEC第Ⅷ因子抗体染色阳性（图3A）。流式细胞仪检测样品抗PECAM-1阳性细胞（图3B）比例为97.1%。台盼兰染色活细胞率92%。

    2.2大鼠Müller细胞生长  大鼠Müller细胞在接种后24h内即可贴壁，第1次换液可将漂浮的和贴壁差的细胞洗掉，剩下的细胞多数为Müller细胞，可能混杂神经元细胞，原代细胞一般7～14d即可长满，按照1∶3方式传代，传代后细胞周期缩短至5～7d，经过2次传代后可获纯度相对较高的Müller细胞。细胞形态主要分为两种：一种胞体较大，不规则片状，折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突的分支少而短（图4A）；另一种胞体较小，蜘蛛状，折光性强，胞突多而长（图4B）。Müller细胞进行GFAP（图5A）和vimentin荧光染色阳性（图5B）。分析对照组与Müller细胞共培养组RMEC生长曲线（图6），发现Müller细胞可以使RMEC提前进入生长平台期。培养5d，共培养组（n＝6）细胞数量为（8.5±3.8）×104，对照组（n＝6）为（3.2±1.4）×104，共培养组RMEC数量较对照组多（P＜0. 01, t＝3.206）。培养10d，共培养组（n＝6）细胞数量为（12.4±4.6）×104，对照组（n＝6）为（12.1±3.0）×104，Müller细胞共培养对RMEC融合期数量没有明显影响（P＞0.01,t ＝0.134）。

    A：游离细胞可结合4~6个磁珠，接种于明胶包被的培养皿中；B：6d贴壁血管内皮细胞；C：第5代培养8d，内皮细胞细胞融合

    图2 原代培养血管内皮细胞形态×100

    A：Ⅷ因子表达阳性；B：PECAM-1表达阳性

    图3 视网膜血管内皮细胞免疫组化染色×100

    A：不规则片状, 折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突呈刺状分支；B：蜘蛛状Müller细胞，折光性强，胞质内原纤维较少，胞突多而长

    图4 Müller细胞形态×100

    A：GFAP表达阳性；B：vimentin表达阳性

    图5 Müller细胞免疫荧光染色×200

    图6 Müller细胞对RMEC生长曲线的影响

    2.3 RMEC细胞周期  由于细胞中DNA成分对于外界影响因子比较敏感，该实验采用无血清培养基尽量减少血清中各种生长调节因子的影响。由于Müller细胞存在使RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相对减少（表1）。24h共培养组（S＋G2）％为55.2％，较无Müller细胞的对照组46.1％高。48h共培养组（S＋G2）％为53.1％，较无Müller细胞的对照组44.8％高。

    2.4迁移实验  传入微孔滤膜培养小室的内皮细胞与在培养板内相似，可很快贴壁生长。当下室无Müller细胞时，6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个，12h为14.7±7.0个。当下室有Müller细胞存在时，迁移的细胞数明显增加，6h移行至膜下的内皮细胞12.2±2.5个，12h为51.7±23.4个，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。在24 h时观察下室存在游离的细胞，多考虑RMEC迁移而入。

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