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3 讨论
由于体内细胞研究受到限制，所以很多人进行视网膜微血管内皮细胞培养[15,16]。传统的组织块和消化培养方法对于可获得视网膜组织量非常少的大鼠RMEC来说非常困难。本实验采用阳性筛选法纯化RMEC，以小鼠抗大鼠PECAM-1单克隆抗体与包被有小鼠IgG的磁珠孵育，使之成为具有抗大鼠PECAM-1的免疫磁珠，与RMEC表面的PECAM-1结合形成细胞磁珠复合体，经过磁场作用与其他细胞分开。免疫磁珠的主要原理是利用包被的磁性微粒，特异性地与靶物质结合，使结合后的磁珠细胞复合体具有磁顺应性，在外加磁场的作用下，结合有靶物质的磁珠被滞留，从而与其他非磁性成分分离，达到纯化富集的作用，并被公认具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性等优点。我们分选出的细胞群，经流式细胞仪检测由磁珠分离法提纯的抗PECAM-1阳性细胞占细胞总数的97％以上。经台盼蓝染色观察，拒染率达92％，提示细胞活力未受明显影响，提纯的细胞可用于细胞生物学和分子生物学后续实验研究。虽然我们借助于MACS可以获得高纯度和高活性的RMEC，但是培养过程中也存在其他细胞污染的问题，其中主要是胶质细胞、周细胞、成纤维细胞。当污染细胞出现的时候，就需要及时处理。我们在培养过程中进行了几项必要的操作，进一步纯化RMEC，否则会影响内皮细胞的生长：当出现小范围的成纤维细胞时，采用机械除杂的方法及时清除；当污染细胞散在，机械除杂不再可行时，重复进行免疫磁珠纯化细胞步骤，或者根据污染细胞和RMEC贴壁时间差异来除杂。这些方法对于RMEC自身特性和活力没有太大的影响。
Müller细胞培养是一项比较成熟的技术，可以采用的方法有组织块法、消化法等，经过后期自然生长和机械除杂方法可以获得纯度较高的细胞。细胞培养数代后，我们发现该细胞存在两种形态（图4），片状细胞多出现在细胞培养早期和融合期底层细胞中，而蜘蛛状细胞多出现在融合期上层细胞，偶尔也可以出现在早期。为了排除其它细胞混杂的可能性，进行PECAM-1、Ⅷ因子、α-actin等抗体染色，结果均成阴性。我们推测这种细胞的不同形态形成有两种可能：一是来源于视网膜部位不同，二是在生长过程中互相转化的。有人认为Müller细胞是存在于视网膜中特化的星形细胞，视网膜与脑组织存在部分相似的结构。脑组织中，根据星状胶质细胞的形态和分布部位不同可分成二种：一种是原浆性星状胶质细胞，分布在灰质内，胞体内原纤维较少，胞突的分支多而短；另一种是纤维性星状胶质细胞，分布在脑和脊髓白质内的神经纤维之间，胞突长而直，分支较少，细胞质内有丰富的原纤维[16-18]。这种特化的星形细胞能否像在大脑中一样具有两种形态呢？另有人认为Müller细胞具有部分祖细胞特性[19-20]，在视网膜中如何进一步分化，和不同微环境及代谢状态有关。目前这些相关Müller细胞研究尚在进行中。应用0.4μm微孔滤膜培养小室，进行Müller细胞与RMEC的联合培养，可以更接近体内视网膜内环境，模拟Müller细胞分泌因子对RMEC的作用。而使用8μm的微孔可允许内皮细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的内皮细胞可粘附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。
我们发现Müller细胞可以加速RMEC生长至融合状态，生长过程中S期（DNA合成期）和G2期（生长后期）比例增加，说明Müller细胞可能分泌一些促进细胞生长的因子。此外在Müller细胞存在的培养环境中对RMEC有趋化迁移作用，这也证明该细胞分泌了一些趋化因子。在正常或缺氧环境中Müller细胞可以分泌多种细胞因子，RMEC受到这些因子正向或者负向调节，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1、肝细胞生长因子(HGF) 和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)等可以促进RMEC生长，转化生长因子(TGF)-β、凝血酶敏感蛋白(TSP)-1 、色素上皮衍生因子(PEDF)等抑制RMEC生长。正相和负相调节因子稳态被打破是造成血管形成的根本原因[21,22]。我们培养过程中Müller细胞条件培养基促进RMEC增生和迁移，说明正向调节强于负向调节，有利于血管形成。本结果与Behzadian等[23]相反，他们进一步研究Müller细胞分泌TGF-β等因子抑制了RMEC生长。但Eichler等[24]和Beuckman等[25]实验结果发现Müller细胞分泌多种促进RMEC生长的因子，促进细胞增生和分化，我们实验结果与此部分相同。通过对文献回顾，我们也认为血管形成与否可能依赖于两种因子的平衡状态。
致谢：德国洪堡基金会(Alexander von Humbo ldt Foundation)仪器设备捐赠基金(V-8151/02085)资助。
【参考文献】
1 Chang-ling T, Halasz P, Stone J. Development of retinal vasculature in the cat: processes and mechanisms. Curr Eye Res ,1990;9(5):459-478
2 Gariano RF, Iruela-Arispe ML, Sage EH, Hendrickson AE. Immunohistochemical characterization of developing and mature retinal blood vessels. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1996;37(1):93-103
3 Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med, 2000;6(4):389-395
4 Fruttiger M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2002;43(2):522-527
5 Reichenbach A, Robinson SR. Neuroglia. Oxford University Press,1995:58-59
6 Gardner TW, Lieth E, Bonsall DJ, Lesher T, Khin SA, Rice K, Barber AJ, Brennan WA. Astrocytes increase barrier properties and ZO-1 expression in cultured retinal capillary endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1997;38(11):2423-2427
7 Zhang Y, Stone J. Role of astrocytes in the control of developing retinal vessels. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997;38(9):1653-1666
8 Penfold PL, Provis JM, Madigan MC, van Driel D, Billson FA. Angiogenesis in normal human retinal development: involvement of astrocytes and macrophages. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol ,1990;228(3):255-263
9 Matsubara TA, Murata TA, Wu GS, Barron EA, Rao NA. Isolation and culture of rat retinal microvessel endothelial cells using magnetic beads coated with antibodies to PECAM-1. Curr Eye Res ,2000;20(1):1-7
10 Hewitt PW, Murray JC. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. Eur J Cell Biol ,1993;62(2):451-454
11刘洪雷,惠延年,刘军,王雨生.改良人视网膜微血管内皮细胞原代培养及鉴定.眼科新进展,2005;25(3):197-200
12 Wang YS, Fruedrichs U, Eichler W, Hoffmann S, Wiedemann P. Advanced glycation endproducts enhance proliferation, but not tub formation in choroidal microvascular endothelial cells. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi), 2005;5(2):209-216
13 Reichenbach A, Stolzenburg JU, Wolburg H, Hartig W, el-Hifnawi E, Martin H. Effects of enhanced extracellular ammonia concentration on cultured mammalian retinal glial (Müller) cells. Glia ,1995;13(3):195-208
14孙慧勤,卞修武,陈意生,史景泉.去甲二氢愈创木酸对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响.中华病理学杂志,2000;29(1):30-33
15孙旭芳,曾水清,张虹,杨红,李贵刚,李晓青.血管抑素抑制鼠视网膜微血管内皮细胞增生及视网膜新生血管形成的研究.中华医学杂志,2004;84(20):1732-1736
16 Mugnaini E, Walberg F. Ultrastructure of neuroglia. Ergeb Anat Entwicklungsgesch ,1964;37:194-236
17 Rosewater K, Sontheimer H. Fibrous and protoplasmic astrocytes express GABAA receptors that differ in benzodiazepine pharmacology. Brain Res ,1994;636(1):73-80
18 Raff MC, Miller RH, Noble M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature ,1983;303(5916):390-396
19 Walcott JC, Provis JM. Müller cells express the neuronal progenitor cell marker nestin in both differentiated and undifferentiated human foetal retina. Clin Exp Ophthalmol ,2003;31(3):246-249
20 Mayer EJ, Carter DA, Ren Y, Hughes EH, Rice CM, Halfpenny CA, Scolding NJ, Dick AD. Neural progenitor cells from postmortem adult human retina. Br J Ophthalmol ,2005;89:102-106
21 Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid, and other diseases. Nat. Med ,1995;1(1):27-31
22 Eichler W, Yafai Y, Wiedemann P, Reichenbach A. Angiogenesis-related factors derived from retinal glial (Müller) cells in hypoxia. Neuroreport ,2004;15(10):1633-1637
23 Behzadian MA, Wang XL, Jiang B, Caldwell RB. Angiostatic role or astrocytes: Suppression of vascular endothelial cell growth by TGF-β and other inhibitory factor(s). Glia ,1995;15(4):480-490
24 Eichler W, Yafai Y, Kuhrt H, Grater R, Hoffmann S, Wiedemann P, Reichenbach A. Hypoxia: modulation of endothelial cell proliferation by soluble factors released by retinal cells. Neuroreport ,2001;12(18):4103-4108
25 Beuckmann CT, Dernbach K, Hakvoort A, Galla HJ. A new astrocytic cell line which is able to induce a blood-brain barrier property in cultured brain capillary endothelial cells. Cytotechnology ,1997;24(7):11-17 上一页 [1] [2] |
