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2结果
2.1眼眶成纤维细胞生长过程 TAO患者与正常对照的OF在体外均较易生长，细胞形态区别不明显。在接种5～7d后，可见组织块周围有少量细胞游出(图1A，B)，呈细长梭形，胞体两端长突起，有的可相互连接成网状。7～9d后细胞大量游出,呈典型的梭形,胞体较丰满 (图1C，D)。正常人与TAO患者的OF,换液后生长较快，约2wk左右细胞均达到融合，此时可见细胞密集成片，难分彼此，相互重叠，可进行首次传代（图1E，F）。传代后细胞生长较快，3～5d就可再次传代，反复换液和传代，即可得到纯化的细胞，且生物学性状相对稳定(图2)。
图3 OF（HE×100） A：正常人；B：TAO患者
图4 OF（SABC×100） A：正常人；B：TAO患者
2.2眼眶成纤维细胞的染色和鉴定 HE染色可见正常人与TAO患者的眼眶成纤维细胞呈两头长突起的梭形，胞质丰富、色浅红，胞核呈椭圆形、色浅蓝，位于细胞中央，核仁不明显(图3A,B)。细胞Vimentin染色均呈阳性,阳性棕色反应产物均匀分布于胞质中(图4A,B)。而Desmin，S100，CK染色阴性,鉴定为成纤维细胞。
3讨论
为了深入研究TAO,建立符合实验要求的动物模型，Many等[6]利用基因免疫的方法于1999年在哺乳动物Balb/c鼠活体内建立了甲状腺相关眼病动物模型，其特征包括：有甲状腺疾病，眼眶组织的眼外肌增粗，球后组织水肿，眶内有严重的脂肪堆积和淋巴细胞浸润。国内目前该领域的研究工作也正在开展，这为我们深入研究TAO开创了新的途径，但体外细胞培养的实验模式在临床疾病的机制和药物研究方面也有不可替代的作用，特别是近年来在中药药效学及有效成分筛选等方面不失为一种经济有效的方法[7]。目前眼眶成纤维细胞的培养技术已较为成熟，在培养过程中，可观察到体外培养的OF属贴壁型细胞，培养成功的关键在于接种的组织块是否能牢固的贴壁，因此，接种组织块后，等待翻转培养瓶的时间及初次所加培养液的量尤为值得注意[8]。各类书籍和文献的报道差别较大，在实验过程中，经过反复比较，5～8h后翻转培养瓶，以3mL的培养液初次培养，可减少组织块的损耗量，组织块基本能紧贴瓶底而不浮起。
眼眶成纤维细胞的体外培养是成功的，实验中我们观察到，TAO患者与正常人OF在体外培养均较易生长，细胞游出与传代的时间基本一致，相差显微镜下可观察到细胞形态，且二者无明显差异，免疫组织化学鉴定方法显示，OF表达Vimentin但不表达CK，与上皮细胞区别;不表达S100，与黑色素细胞相区别;不表达Desmin，与肌细胞相区别，说明细胞为间叶来源，证实为成纤维细胞，为下一步试验打下了基础。
【参考文献】
1 Bahn RS, Gorman CA, Woloschak GE, et al. Human retroocular fibroblasts in vitro: a model for the study of Graves' ophthalmopathy. J Clin Endocrinol Metab 1987;65(4):665670
2郑健墚，郭彦，张洁，等.人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养.解剖学研究1999;12;21（2）:9697
3惠延年.眼科学.北京：人民卫生出版社2001:194195
4肖利华，宋国祥.眼眶手术学及图解.郑州：河南科学技术出版社1999:219220
5司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安：世界图书出版公司2004：264266
6 Many MC, Costagliola S, Detrait M, et al. Development of an animal model of autoimmune thyroid eye disease. J Immunol 1999;162(8):49664974
7李蓓，郑燕林，江文，等.眼眶成纤维细胞与甲状腺相关眼病.国际眼科杂志2008;8(5):10081011
8董凯，何为民，罗清礼.甲状腺相关眼病组织病理学研究.国际眼科杂志2008;8(6):11591161 上一页 [1] [2] |
