视网膜色素上皮细胞对结膜囊成纤维细胞的影响
现代康复 2000年第5期第4卷 其它
作者：胡丹 惠延年 PhilipP.Chen
单位：胡丹 惠延年（解放军第四军医大学西京医院,陕西西安710032）；PhilipP.Chen（美国华盛顿大学医学院,西雅图98195）
关键词：视网膜色素上皮细胞调理液；人结膜囊成纤维细胞；细胞增殖；胶原合成
摘要 目的：观察人视网膜色素上皮（RPE）细胞调理液（RPE－CM）对人结膜囊成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。方法：用MTT比色法、3H－脯氨酸掺入法和原位杂交法观察RPE－CM对体外培养的成纤维细胞生长及胶原合成活性的作用。结果：RPE细胞培养调理液可使成纤维细胞的OD值明显增高（P＜0.01），还可使成纤维细胞3H－脯氨酸掺入的CPM值明显高于对照组（P＜ 0.01）。处理组成纤维细胞中Ⅰ型前胶原mRNA原位杂交信号明显增强。结论：RPE－CM可刺激成纤维细胞生长及胶原合成，此作用与RPE细胞的去分化程度有关。
中图分类号 R774.1 文献标识码 A 文章编号 1007－5496(2000)05－0714－02
Effects of the retinal pigment epithelial cell－ conditioned medium on proliferation and collagen synthesis of human Tenon's capsule fibroblasts
HU Dan
(Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032,China)
HUI Yan-nian
(Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032,China)
Philip P.Chen.
(Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032,China)
Abstract Objective: To investigate the effects of the retinal pigment epithelial(RPE) cell－ conditioned medium(RPE－ CM) on the proliferation and collagen synthesis in human Tenon's capsule fibroblast. Methods: The cultured human Tenon's fibroblasts were exposed to RPE－ CM, cell growth were measured by MTT assay and 3H－ proline incorporation was performed to determin the collagen production, the type Ⅰ procollagen mRNA expressions were observed by in situ hybirdization. Results: When fibroblasts were cultured with RPE－ CM, the OD and CPM values in MTT assay and 3H－ proline incorporation were elevated. 24 hours after cultured with Ⅰ ° RPE－ CM the type Ⅰ procollagen mRNA level were significantly enhanced in comparison with control. Conclusion: RPE－ CM can stimulate the proliferation and collagen synthsis of fibroblasts. Futhermore, this function is related to the degree of the RPE dedifferation.
Key words retinal pigment epithelial cell-conditioned medium;human tenon's capsule fibroblast;cell proliferation;collagen synthesis
在眼外伤的修复过程中，增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是极为严重的后果之一。视网膜色素上皮细胞（RPE）及成纤维细胞在此过程中都起着重要的作用。视网膜色素上皮细胞被证实在活化后可表型改变，增殖并具有自分泌功能，可对其他细胞进行调节、趋化、促增殖等作用[1,2]，成纤维细胞则是合成细胞外基质最主要的细胞之一。在外伤性PVR中，成纤维细胞主要来源于修复伤口的结膜囊或巩膜表层的纤维细胞，其大量存在于PVR的增殖期及组织重建期[3,4]。因此，了解RPE细胞对成纤维细胞的影响，对更进一步地了解外伤性PVR的发生、发展过程并在临床上寻求更多的治疗途径，对伤眼视功能的康复都有一定的意义。本实验将体外培养的人RPE细胞上清即RPE细胞调理液（RPE cell－conditioned medium,RPE－CM）加入结膜囊成纤维细胞的培养液中，观察成纤维细胞增殖及胶原合成的变化。
1 资料与方法
1.1 材料 细胞及组织：人视网膜色素上皮细胞由第四军医大学西京医院眼科刘兵博士提供。人结膜囊组织取自第四军医大学西京医院眼科白内障手术患者。
试剂及仪器：四氮唑盐（MTT）、DMEM培养液为美国Sigma公司产品，小牛血清、胰蛋白酶/EDTA为美国Gibco公司产品，3H－脯氨酸为中国原子能研究所产品，Proα（I）cDNA探针由中国预防医学科学院劳卫所购得，DLG－DNA标记试剂盒为德国宝灵曼公司产品。LeicaQ570C彩色图像分析仪为德国Leica公司产品。
1.2 方法
1.2.1RPE－CM的获取培养第1代及第5代的RPE细胞接种附壁后，弃去原培养液，DMEM洗涤3次，加入不含血清的DMEM，37℃5％CO2培养箱中培养24h及72h后，收集上清液，1500rpm离心10min，提取上清，冻存于－20℃冰箱中直至使用。
1.2.2人结膜囊成纤维细胞的培养将获得的结膜囊组织，经洗涤，消化后，用含10％小牛血清的DMEM于37℃5％CO2培养箱中培养，选择第3～6代细胞用于实验。
1.2.3RPE－CM处理将成纤维细胞接种至96孔板，用不含血清的DMEM继续培养24h后，弃去培养液。处理组分别加入培养24h、72h的第1代、第5代RPE－CM（Ⅰ°24hRPE－CM、Ⅰ°72hRPE－CM、Ⅴ°24hRPE－CM、Ⅴ°72hRPE－CM），每孔200μl，对照组加入不含血清DMEM培养液，继续培养24h。
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