1.2.4MTT比色实验处理组及对照组每孔加5mg/mlMTT20μl，继续培养4h后，弃去培养液，加入DMSO150μl/孔，微型振荡器上振荡15min，在570mm波长测定光密度值（OD）。每孔设4个复孔，实验重复3次，细胞增长率=（实验组OD组/对照组OD值－1）×100％。

　　1.2.53H－脯氨酸掺入实验处理组及对照组每孔加入2μCi3H－脯氨酸，继续培养24h，收集细胞于F4玻璃纤维滤纸，自动液闪计数仪测定样品的放射性CPM值，每组设4个复孔，实验重复3次。掺入增殖率=（实验组CPM值/对照组CPM值－1）×100％。

　　1.2.6I型前胶原原位杂交实验培养成纤维细胞于盖玻片上至细胞铺满，0.01MPBS洗涤3次后，细胞爬片置入不含血清的DMEM中继续培养24h，弃去原培养液后，加入Ⅰ°72hRPE－CM，37℃5％CO2培养箱中培养24h，对照组RPE－CM改为DMEM，余步骤相同。Proα1（I）cDNA探针标记后行RNA原位杂交，结果照像并在LeicaQ570C彩色图像分析仪上进行图像分析。

　　1.2.7统计学分析实验结果均取均数±标准差，行t检验。

　　2　结果

　　2.1　RPE－CM对成纤维细胞生长的影响　处理组OD值较对照组明显增高，且第1代RPE－CM均高于第5代RPE－CM，但24h与72hRPE－CM间无明显差异见表1。

　　表1　RPE－CM对成纤维细胞MTT比色的影响

　　2.2　REP－CM对成纤维细胞胶原合成的影响　经RPE－CM处理的成纤维细胞CPM值明显高于未处理组，同样，第1代RPE－CMCPM值均高于第5代RPE－CM，但24h与72hRPE－CM间亦无显著差异见表2。

　　表2　RPE－CM对成纤维细胞3H－脯氨酸掺入的影响

　　图1　对照组成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA原位杂交（×200）

　　图2　RPE－CM处理组成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA原位杂交（×200）

　　3　讨论

　　PVR的发生发展过程实质上仍是一个组织创伤修复的过程。在这个过程中，许多细胞参与其中，而RPE细胞现在被认为是PVR发生发展过程中最重要的细胞之一[5]。

　　大量研究表明，在血视网膜屏障破坏后，RPE细胞暴露外界刺激因素之下可发生表型转化，可从分化细胞转化为去分化细胞，此时的RPE细胞可分泌合成细胞外基质并有收缩功能，而在这个过程中，它自身可分泌多种化学性多肽对其它细胞进行调节。有研究报告RPE细胞分泌的多种因子具有促进细胞有丝分裂、趋化性及血管生成等作用，且RPE细胞分泌生物活性因子的能力随着其去分化的程度而降低[6]。由于成纤维细胞在外伤性PVR发生发展过程中所起的作用以及它与RPE细胞之间的密切关系，我们在本实验中使用第1代及第5代培养24h及72h的RPE细胞调理液作用于体外培养的人结膜囊成纤维细胞24h，观察其对成纤维细胞数量、胶原合成的影响，同时还观察了第1代RPE细胞调理液对成纤维细胞中Ⅰ型前胶原合成的影响，结果4种条件下RPE细胞调理液均可使成纤维细胞数目较对照组明显增多，而第1代RPE细胞调理液作用强于第5代细胞调理液，证实了分化RPE细胞所分泌刺激成纤维细胞生长因子的功能要强于转化的RPE细胞，而培养第3天的调理液对细胞的促生长作用与培养第1天的调理液无统计学差异，说明RPE细胞分泌因子并不依赖于培养时间的长短。同时，RPE细胞调理液还可使成纤维细胞3H－脯氨酸的掺入率明显提高，证实其分泌活性因子不仅可促进成纤维细胞生长，还可使其合成胶原增加，但成纤维细胞胶原合成的增加与细胞数量的增加并不完全一致。本实验中RPE细胞调理液可增强成纤维细胞中Ⅰ型前胶原mRNA表达的结果也证实了RPE细胞在受外界刺激表型转化的进程中所分泌出的一些活性因子从转录水平促进了成纤维细胞胶原的合成。说明RPE细胞表型转化及分泌活性因子，在眼外伤的早期细胞的增殖及以后增殖膜的形成与收缩，对外伤性PVR的形成和发展，起着重要的作用，有助于我们进一步了解外伤性PVR等眼内增生性疾病的病理过程，并寻求临床治疗的关键环节。

　　作者简介　胡丹(1964－)，男，江西南昌人，博士,1997～1998年在美国华盛顿大学医学院眼科进修。研究方向：眼外伤及青光眼等。

　　参考文献

　　[1]Machemer R, Van Horn DL, Aaberg TM. Pigment epithelial prolifera tion in human retinal detachment with massive periretinal proliferation[J]. Am J Ophthalmol, 1978,85:181～ 186

　　[2]Ussmann JH, Lazarides E, Ryan SJ. Tractio retinal detachment. A Cell－ mediated event[J]. Arch Ophthalmol, 1981;99:869～ 876

　　[3]Guidy C, Hardwick C. Extracellular matrix contraction by choroidal fi broblasts: inhibition by staurosporine[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35:503～ 508

　　[4]Hiscott P, Grierson I, Trombetta C, et al. Retinal and epiretinal glia: An immunohistochemical study[J]. Br J Ophthalmol, 1984,68:698～ 707

　　[5]Wiedemann P， Weller M. The pathophysiology of proliferative vitreo retinopathy[J]. Acta Ophthalmol, 1988,189:3～ 15

　　[6]Grisanti S, Esser P， Schraermeyer U. Retinal pigment eithelial cells: autocrine and paracrine stiumlation of extracellular matrix contraction[J]. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1997,235:587～ 598

　　(修稿：2000－04－01)

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