作者：张 娇，王又东，张劲松    作者单位：（110001）中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第四医院眼科

    【摘要】  目的：建立兔角膜移植高危模型，通过联合阻断CD28和ICOS，探讨CTLA4-Ig及ICOSmAb对角膜移植排斥反应的影响。方法：实验动物随机分成4组，每组10只。联合阻断组：植片为浸入含有CTLA4-Ig和ICOSmAb的中期保存液中。ICOS组：植片为浸入含有ICOSmAb的中期保存液中。CTLA4组：植片为浸入含有CTLA-4Ig的中期保存液中。对照组：单纯角膜移植，不做CTLA-4Ig和ICOSmAb处理组。观察术后受体植片角膜混浊情况和植片病理改变，RT-PCR方法检测植片IL-2，IL-10mRNA的表达情况，应用流式细胞仪检测植片CD4+，CD8+T淋巴细胞表达情况。结果：联合阻断组兔角膜移植片存活时间(92±18)d，较其它3组明显延长（P ＜0.05）；术后21d联合阻断组移植物中IL-2mRNA表达明显降低（P ＜0.05），CD4+，CD8+T淋巴细胞表达明显降低（P ＜0.05）；植片组织病理学检查淋巴细胞浸润较其它3组明显减少。结论：应用CTLA4-Ig和ICOSmAb联合阻断CD28和ICOS，可以明显抑制高危角膜移植排斥反应，提高移植的存活率。

    【关键词】  角膜移植；CTLA4；ICOS

     Simultaneous blockade of inducible co-stimulator and CD28 pathway on prevention of rabbit corneal allografts rejection

    Jiao Zhang, You-Dong Wang, Jin-Song Zhang

    Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

    Abstract AIM: To study the effects of co-stimulatory blockade with anti-inducible co-stimulator antibody in conjunction with CTLA4-Ig on prevention of rabbit corneal allograft rejection.  METHODS: Experimental animals were divided into 4 groups in random, 10 rabbits for each group. The group of dealing with CTLA4-Ig and ICOSmAb, donor corneal preserved in Optisol with CTLA4-Ig and ICOSmAb; the group of dealing with ICOSmAb, donor corneal preserved in Optisol with ICOSmAb; the group of dealing with CTLA4-Ig, donor corneal preserved in Optisol with CTLA4-Ig; Control group: simple corneal transplantation, not with CTLA4-Ig and ICOSmAb. Evaluate the degree of corneal opacity and the change on histology. The expression of CD4+ and CD8+ T cell was detected by flow cytometry. The expression of IL-2 and IL-10mRNA was detected by RT-PCR. RESULTS: Compared with others, survival time of CTLA4-Ig and ICOSmAb group(92±18)d was obviously prolonged, and IL-2mRNA expression was obviously difference（P＜0.05), the numbers of CD4+ and CD8+ T cell was obvious down-regulation on the day 21 after transplantation, the number of lymphocyte decreased in the group of dealing with CTLA4-Ig and ICOSmAb viewing through histology examination.  CONCLUSION: These findings demonstrate that the blockade of co-stimulatory signals with ICOSmAb in conjunction with CTLA4-Ig has a favorable effect to restrain the rejection of corneal transplantation.

    · KEYWORDS: corneal transplantation; rejection; CTLA4 ; ICOS

    0引言

    高危型角膜移植存活率不高，主要原因是移植术后各类排斥反应[1]。研究表明CTLA4-Ig [2]和一种新的共同刺激分子-ICOS [3]（inducible co-stimulater）在移植排斥中发挥重要的作用。我们在兔高危角膜移植模型基础上，通过联合阻断CD28和ICOS，研究CTLA-4Ig及ICOSmAb对角膜移植排斥反应的抑制作用，为其应用于临床提供可供选择的免疫抑制治疗方案。

    1材料和方法

    1.1材料 新西兰白兔65只，2.0～2.5kg，8～12周龄，雌雄不限，购自中国医科大学实验动物中心。 其中45只兔制作高危角膜移植受体动物模型，其余20只兔作为供体。随机分成4组，每组10只。联合阻断组：植片为浸入含有CTLA-4Ig(1mg/L)和ICOSmAb的中期保存液中。ICOS组：植片为浸入含有ICOSmAb的中期保存液中。CTLA4组：植片为浸入含有CTLA-4Ig的中期保存液中。对照组：单纯角膜移植，不做CTLA-4Ig和ICOSmAb处理组。

    1.2方法 兔高危角膜移植受体模型：右眼角膜4个象限分别间断缝合1针（5-0丝线），跨距2mm，深达2/3角膜基质层，2wk新生血管长入角膜后拆线。其余20只作为供体。选择[4]大于3个象限，新生血管长入角膜3mm的40只兔在角膜缝线拆除3～6d之间进行穿透性角膜移植术，氯胺酮（50mg/kg）和氯丙嗪（10mg/kg）混合im全身麻醉，角膜新生血管化兔作为受体行同种异体穿透性角膜移植，植片与植床直径分别为7.5和7.0mm，10-0尼龙线间断缝合12针至水密状态，平衡盐溶液形成前房。4组行角膜移植后2wk内隔日，又每周2次对植片混浊，水肿，新生血管生长进行观察。记录排斥指数（rejection index RI,角膜混浊，水肿，新生血管评分合计）[4]：应用双盲法裂隙灯显微镜检查植片情况连续检测100d（在临床医学上，移植物生存超过100d视为长期存活），具体评分标准如下：角膜混浊：0分，角膜透明：1分，角膜轻度混浊；2分，角膜混浊加重，前房结构依然清楚；3分，角膜混浊明显混浊，前房结构模糊不清；4分，角膜白色混浊，前房不入。角膜水肿：0分，角膜无水肿；1分，角膜基质轻度增厚；2分，角膜基质弥漫水肿；3分，2分伴上皮下微小水泡；4分，大泡性角膜病变。角膜新生血管：0分，植片无新生血管；1分，新生血管长入植片1个象限；2分，新生血管长入植片2个象限；3分，新生血管长入植片3个象限；4分，新生血管长入植片4个象限。RI达到或超过6分判定为免疫排斥反应。

    1.2.1角膜植片组织IL-2, IL-10mRNA的表达 各组排斥反应发生时或术后21d行RT-PCR检查。在无菌条件下取出移植物角膜按Trizol试剂盒（上海生工）提取总RNA，逆转录酶作用下RT-PCR反应合成cDNA，PCR反应体系为50μL，IL-2引物：5′-CAA AGG AAA CAC AGC AGC ACC TGG-3′，3′-TCC TCA GAA ATT CCA CAG TTG C-5′，342bp；IL-10引物：5′-TTA AGG GTT ACT TGG GTT-3′，3′-TTG CTT TTA TTC TCA CAG G-5′，190bp；β-actin引物：5′-TAC AAT GAG CTG CGT GT-3′，3′-AGA TGG GCA CAG TGT GCC-5′，226bp。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性45s，56～58℃退火1min（IL-2 56℃，1L-10 57℃，β-actin 58℃），72℃延伸1min，循环35次，最后一个循环72℃延伸8min；琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，用UVP凝胶图象扫描系统进行密度扫描，以目的基因扩增量/β-actin基因扩增量表示所要检测基因的表达量。

    1.2.2 T淋巴细胞亚群的表达 应用流式细胞仪检测移植术后21d实验各组CD4+和CD8+T淋巴细胞的表达。重复管里加入PE-CY5-anti-CD3抗体、FITC-anti-CD4mAb和PE-anti-CD8mAb,对照管里加入PE -Ig，进行免疫标记反应。4℃作用30min，离心(1 000r/min，5min)，弃上清液，沉淀中加入5mL的PBS液，离心( 1 000r/min，5min)，重复洗涤1次，然后流式细胞仪中进行检测。

    1.2.3 组织病理学检查 发生排斥反应时或术后21d分别切取受者角膜,40g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，镜下观察。

    统计学处理: 所用数据均经SPSS11.5处理，以均数±标准差表示,采用方差分析q检验，采用Kruskal-Wallis test，P＜0.05为差异有统计学意义。

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