2结果

    2.1角膜移植后病理观察 联合阻断组兔角膜移植片存活时间较其它3组明显延长（P＜0.05，表1）。对照组角膜移植术后2wk植片混浊，新生血管长入，无植片存活时间超过100d，平均生存时间21±4d；CTLA4组角膜移植术后植片6只存活时间超过100d，平均生存时间为（70±31）d；ICOS组角膜移植术后植片5只存活时间超过100d，平均生存时间为（69±34）d；联合组角膜移植术后植片7只存活时间超过100d，平均生存时间为(92±18)d。移植后21d，联合阻断组角膜植片无明显炎性细胞浸润，角膜结构基本正常。对照组可见角膜炎性细胞浸润，角膜厚度增加等。

    2.2 IL-2，IL-10mRNA水平变化 移植术后21d，联合阻断组IL-2mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），而IL-10mRNA表达水平变化不明显（P＞0.05，表1和图1）。

    2.3 CD4+和CD8+T淋巴细胞表达 移植术后21d，联合阻断组CD4+和CD8+T淋巴细胞表达明显减少(P＜0.05，表1)。

    3讨论

    角膜移植是目前器官和组织移植成功率最高的手术，但术后的免疫排斥反应仍是手术失败的最主要原因[1]，尤其在血管化、角膜严重感染或大植片移植术后，免疫排斥率高达60%[5]。在器官移植排斥反应中，诱导抗原特异性免疫应答时，T细胞激活必须接受抗原递呈细胞（APC）递呈的双重信号[6,7]，调节T细胞开始增殖并分泌细胞因子。现代免疫学研究进展表明，在角膜移植排斥反应中，由CD4+T细胞识别特异性抗原，在其辅助下，由CD8+T细胞完成。多年来的研究表明，最重要的一组共同刺激分子是CD28/B7，如果阻断B7与受体相结合，抑制第二信号的产生，将可能导致T细胞的克隆失活或克隆无反应，诱导免疫耐受[8]。但最近有研究表明，虽然阻断B7/CD28共刺激信号途径可以在一定程度上抑制急性期的移植排斥反应，但效果并不十分理想。1999年发现了一种新的共刺激分子，命名为ICOS (inducible co-stimulator)后Kirk等[9]发现，阻断CD28途径并刺激ICOS，可以活化T细胞，并分泌相应的细胞因子，这说明ICOS可以补偿CD28信号的缺乏。由此我们认为，共刺激信号途径存在多个备选通路，单纯阻断其中一条并不能诱导持久稳定的免疫耐受状态，要想获得更好的阻断效果，就必须联合阻断二者。

    既然CD28/B7和ICOS在蛋白质结构、基因位点、作用途径及功能等方面有如此多的相似之处，而且两者的受配体间没有交叉反应，同时二者在单独应用时又体现出了各自不同但又互补的作用。本实验利用同时阻断ICOS/ICOSL共刺激信号途径，与单一阻断CD28或ICOS途径比较，明显延长了移植角膜有功能存活时间。HE染色显示联合组移植术后21d角膜形态较完整，未见淋巴细胞浸润。IL-2[10]多年来被认为在体内负责CTL的活化增殖，因此利用抗IL-2抗体阻断IL-2R抗体阻断IL-2信号途径可以抑制器官移植排斥反应。本实验中联合阻断组IL-2等细胞因子较对照组及其他实验组有显著下降，说明联合阻断降低排斥反应可能是通过共刺激信号途径有效抑制或减低这些细胞因子。研究表明[11]，Th1淋巴细胞通过产生IL-2和INFr与诱导免疫排斥反应相关，Th2淋巴细胞通过产生IL-10与诱导免疫耐受相关，移植后免疫耐受时常伴随IL-10的高表达，即IL-2是诱导免疫排斥反应的重要细胞因子之一，而IL-10则与诱导免疫耐受有密切关系。本研究联合阻断组移植角膜组织中IL-2mRNA呈低表达，而对照组呈高表达，IL-10mRNA在4组中均呈中等程度表达，提示联合阻断组中Th1淋巴细胞降低、Th2淋巴细胞增高，阻断共刺激信号后使得免疫反应向Th2途径偏离。结果提示，联合阻断共刺激信号可有效抑制排斥反应的发生，明显延长高危角膜移植后角膜存活时间。本实验表明，联合阻断CD28/B7和ICOS/ICOSL共刺激信号途径，获得了一加一等于甚至是大于二的抑制效果，为今后联合阻断多个共刺激通路诱导受体获得更稳定持久的免疫耐受状态奠定实验基础，并可能寻找到一种全新的治疗方案，以代替目前使用的抗排斥药物，并为临床提供了有用的实验依据。

    【参考文献】

    1 Price MO, Thompson RW Jr, Price FW Jr. Risk factors for various causes of failure in initial corneal grafts. Arch Ophthalmol ,2003;121:1087-1092

    2 Gebhardt BM, Hodkin M, Varnell ED, Kaufman HE. Protection of Corneal Allografts by CTLA4-Ig. Cornea ,1999;18(3):314-320

    3 Hutloff, Dittrich M, Beier KC, Eljaschewitsch B, Kraft R, Anagnostopoulos I, Kroczek RA. ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature ,1999;397(6716):263-266

    4 Mills RA, Jones DB, Winkler CR. Topical FK-506 prevents experimental corneal allograft rejection. Cornea ,1995;14:157-160

    5史伟云,谢立信.重视角膜移植术后免疫排斥反应的防治.中华眼科杂志,2006;42:3-5

    6李琦,席兴华.角膜移植免疫排斥反应防治的研究进展.国际眼科杂志,2006;6(5):1126-1129

    7 Liu Y, Janeway CA Jr. Interferon γplays a critical role in induced cell death of effect or T cell: a possible third mechanism of self-tolerance. J Exp Med ,1990;172(6):1735-1739

    8 Kirk AD, Harlan DM, Armstrong NN. CTLA4Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Nat Acad Sci USA ,1997;94:8789-8794

    9钟敬祥,朱春玲,徐锦堂,李辰,刘莲.角膜移植患者外周血中T细胞CD28分子的表达及其意义.眼科新进展,2005;25(2):130-131

    10 Nelson BH. IL-2, regulation T cells, and tolenrance. J Immunol ,2004;172:3983-3988

    11 Tafuri A, Shahinian A, Bladt F. ICOS is essential for effective T-helper-cell responses. Nature ,2001;409:105-108

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