作者：付金玲 王桂云 隋桂琴 邹贺 作者单位：吉林大学第二医院眼科医院，吉林 长春 130041吉林省镇赉县卫生局卫生监督所
【摘要】 目的 研究塞来昔布对糖尿病（DM）大鼠视网膜血管内皮生长因子（VEGF）表达及视网膜超微结构的影响。 方法 将40只Wistar大鼠用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制成DM大鼠模型，随机分成DM组（n=20）和塞来昔布灌胃组（n=20）。另15只正常大鼠为正常对照组。3个月后处死全部大鼠，取视网膜进行透射电镜观察，应用免疫组化检测视网膜VEGF蛋白表达。结果 塞来昔布灌胃组视网膜内皮细胞、神经节细胞凋亡较DM组明显减轻。正常对照组视网膜VEGF免疫组化反应阳性弱，VEGF蛋白表达量低；DM组视网膜VEGF免疫组化反应呈强阳性，VEGF蛋白表达增高(P＜0.01)；塞来昔布灌胃组VEGF免疫组化反应阳性减弱，VEGF蛋白表达降低(P＜0.01)。 结论 塞来昔布能够抑制STZ诱导的DM大鼠视网膜VEGF蛋白表达,并减轻视网膜超微结构损害。
【关键词】 糖尿病视网膜病；内皮生长因子；塞来昔布
基金项目：吉林省科技发展计划资助项目（20050111）
Effect of celecoxib on early retinopathy in rats with experimental diabetes mellitus
【Abstract】 Objective To investigate the effect of celecoxib on vascular endothelial growth factors (VEGF) and ultrastructure in diabetic rats.Methods Forty Wistar rats were used to establish diabetic models by intraperitoneal injecting with streptozotocin，and were divided into diabetes mellitus group (n=20) and celecoxib group(n=20).Fifteen else rats were in normal control group.All of the rats were executed 3 months later.Elecotronic microscope was used to observe retinal ultrastructrue change，and the expression of VEGF protein was studied by immunohistochemistry.Results Compared with diabetes mellitus group，retinal vessel endothelium and ganglion cell apoptosis decreased much less in celecoxib group.The expression of VEGF in diabetes mellitus was higher than that of normal group and lower than that of celecoxib group (all P＜0.01).Conclusions Celecoxib can inhibit the expression of VEGF in retina of diabetes mellitus and relieve the damage of retinal ultrastructure.
【Key words】 Diabetic retinopathy；Endotheliar growth factors；Celecoxib
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病(DM)常见和严重的眼部并发症之一，已成为目前世界上主要的致盲眼病之一，如何早期预防和治疗DR是当前眼科领域攻关的重要课题。研究表明血管内皮生长因子（VEGF）参与DR病理变化，并在视网膜新生血管的发生发展过程中起着重要作用〔1，2〕。新近研究表明COX2在DM大鼠视网膜中表达含量显著增高〔3〕,提示COX2在DR的病情进展过程中起着十分重要的作用,阻断COX2在视网膜病变中的作用,可能影响DR的发生和发展。本实验旨在探讨VEGF在链脲佐菌素(STZ)诱导的早期DM大鼠视网膜中表达情况及选择性COX2抑制剂——塞来昔布对DR视网膜VEGF表达和视网膜病变的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性Wistar大鼠55只，体重150～160 g,由吉林大学基础实验室提供。VEGF单克隆抗体、DAB及免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。COX2单克隆抗体、DAB及免疫组化试剂盒均购自广州中山生物技术有限公司。塞来昔布购自美国辉瑞公司。STZ购自美国Sigma公司。One Touch血糖测定仪为美国强生Lifescan公司产品。透射电子显微镜为日本产JEM1200EX。
1.2 造模和分组
40只大鼠空腹12 h后，用STZ诱发DM。临用前用0.1 mol/L枸橼酸盐溶液配成1%浓度，经微孔滤膜过滤灭菌，按60 mg/kg左下腹腔内注射，72 h后取尾血测血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L者确定为DM大鼠。另15只大鼠为正常对照组，每只腹腔内注射等体积枸橼酸盐溶液。DM大鼠随机分为DM组和塞来昔布灌胃组。DM模型建立第2天，塞来昔布灌胃组大鼠经口灌胃塞来昔布50 mg/kg，2次/d，DM组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠单笼喂养，自由进食、饮水。于大鼠血糖升高后每月测体重及血糖1次。所有大鼠饲养3个月。除去死亡及血糖恢复正常大鼠，最终每组15只入组。
1.3 一般组织学处理
喂养3月末，过量麻醉处死大鼠，轻摘眼球，一眼放入预先配置的2.5%戊二醛溶液中固定，另一眼放入预先配置的10%中性甲醛溶液中。
1.4 视网膜电镜观察
取经2.5%戊二醛溶液中固定后的眼球，于锯齿缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，分离视网膜，1%锇酸染色，Epon环氧树脂812包埋，半薄切片光学定位（1 μm），瑞典产LKBⅢ型超薄切片机切片(70 nm)，电子染色，日本产JEM1200EX透射电镜观察、拍片。
1.5 视网膜VEGF表达
取经10%中性甲醛溶液中固定后的眼球，于锯齿缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，余下眼杯行全层石蜡包埋，4 μm连续切片。VEGF抗体稀释度均为1∶100，染色步骤按免疫组织化学说明书进行，采用SP法，经DAB显色，苏木素复染后，阳性细胞呈棕色，用PBS代替一抗作为阴性对照。通过与电脑相连的HPIAS1000型高清晰度彩色病理图文分析系统作细胞VEGF蛋白表达的半定量分析。每张切片随机选取５个视野，计算阳性信号平均灰度值。用阳性产物的灰度值来表示免疫反应表达程度。
1.6 统计学分析
数据以x±s表示,组间比较采用t检验。
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