作者：曲虹 牛膺筠 王建波 李光达 刘夫玲 作者单位：青岛大学医学院附属医院眼科，山东 青岛 266003
【摘要】 目的 观察早期糖尿病大鼠视网膜神经细胞结构变化、caspase3表达及氨基胍的治疗作用。方法 健康成年Wistar大鼠50只，12只作为正常对照组，其他大鼠链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射建立糖尿病(DM)大鼠模型，并随机分为氨基胍治疗组及DM模型组，每组又按时间分为1、3、6个月组。透射电镜下观察视网膜超微结构改变，免疫组织化学法检测视网膜组织caspase3蛋白的表达变化。结果 电镜变化：模型1个月组内核层细胞胞质出现不均匀现象；3个月组内核层细胞核个别染色质出现浓缩现象，神经节细胞亦出现超微结构的变化；6个月组上述变化进一步加重，并可在内核层及神经节细胞层发现个别凋亡小体，氨基胍治疗组变化较糖尿病组轻微。免疫组织化学表达：模型3个月组caspase3蛋白开始表达，主要见于神经节细胞层；模型6个月组阳性表达进一步增加，扩展到内核层。氨基胍组caspase3表达变化规律与模型组基本一致，治疗组3个月、6个月阳性表达均分别低于未治疗组(P＜005)。结论 早期DM大鼠视网膜出现了电镜组织学改变，caspase3参与了糖尿病视网膜病变的发病机制。氨基胍对糖尿病视网膜病变有一定的治疗作用。
【关键词】 糖尿病视网膜病变 电镜 氨基胍
糖尿病(DM)视网膜病变是DM常见的严重并发症，是DM患者致盲的主要原因之一。多年来，国内外许多学者对DM视网膜病变进行了大量的实验性和应用性研究，取得了一定的进展，但其确切的发病机制目前还不清楚，以往对DM视网膜病变发病机制的研究主要集中在新生血管上，最近研究发现凋亡在DM视网膜病变中起重要的作用。有研究发现早期DM即出现视网膜组织厚度变薄、神经节细胞数改变、凋亡细胞数量增加以及Bcl2和Bax的表达改变，以上实验证明了在DM早期视网膜组织中不仅毛细血管细胞经历凋亡，神经视网膜部分也有明显的凋亡改变，这些细胞的凋亡可加速DM视网膜微血管病变的发展和视网膜功能的异常〔1〕。本研究观察不同病程DM大鼠视网膜神经细胞超微结构的改变、检测凋亡终末执行酶caspase3的表达，同时观察应用氨基胍的治疗作用，探讨DM视网膜病变的凋亡机制以及氨基胍可能的治疗作用机制，为DM视网膜病变的发病机制及治疗的研究提供依据。
1 材料与方法
11 动物
健康雄性Wistar大鼠，2月龄，50只(河南省实验动物中心)，体重180～200 g。
12 方法
121 DM动物模型的建立及分组
随机选取12只作为正常对照组。其余大鼠制备DM模型。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司产品)用01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 45)配成1%溶液，按60 mg/kg一次性左下腹腔内注射，注射后24～48 h取尾血测血糖(One Touch血糖仪，美国强生公司产品)，血糖＞1665 mmol/L者为DM大鼠。 正常对照组大鼠用等量的缓冲液行腹腔内注射。STZ诱导建立成功的DM大鼠为36只，随机分为DM模型组和氨基胍治疗组,每组取6只制作电镜标本，12只制作免疫组化标本，按时间段又各分为1、3、6个月组。氨基胍组：氨基胍(Aminoguanidine，AG，美国Sigma公司产品)按1 g/L加入大鼠饮水中(每日给予50 mg/kg)。
122 检测指标及结果观察
电镜观察：麻醉固定后取眼球作超薄切片观察、照相。免疫组织化学染色：caspase3免疫组织化学染色，切片脱蜡复水至水，滴加3%H2O2复合消化液、山羊血清，分别滴加兔抗大鼠caspase3蛋白抗体(北京中山生物公司)，滴加山羊抗兔IgG、试剂SABC，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察。应用OPTON VIDAS图像分析系统对结果进行分析(每只眼随机取10张切片，每张切片取4个视野，以视神经为基准分别向两侧各取2个视野，每个视野面积为02 mm×02 mm)，双目显微镜下观察caspase3平均阳性细胞计数。
13 统计学处理
数据用x±s表示，对数据采用SPSS100统计软件进行两组样本均数差别的t检验。
2 结果
21 血糖值变化
经腹腔注射STZ后，36只大鼠血糖在1665 mmol/L以上，并出现多饮、多食、多尿及体重增长缓慢等症状。在饲养期间无大鼠死亡。正常对照组大鼠血糖均在65 mmol/L以下。模型组和氨基胍组间血糖未见差异。
22 视网膜组织中caspase3的表达
正常大鼠和模型1个月组视网膜组织中caspase3蛋白无表达。模型3个月组，caspase3蛋白开始表达，主要见于神经节细胞层，细胞核染色。模型6个月组，阳性表达增加，扩展到内核层，可见棕黄色染色(图1)。氨基胍组caspase3表达变化规律与模型组基本一致，氨基胍组3个月、6个月阳性表达均低于模型组，但差异有显著性，见表1。表1 DM不同时段caspase3的表达变化(略)
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