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23 神经网膜超微结构变化
正常视网膜神经细胞结构清楚。神经节、内核层细胞核染色质均匀，细胞器结构清楚。神经纤维层结构清楚。外核层(视杆细胞核区)排列整齐,核染色质分布均匀;视杆细胞内节中具有线粒体等细胞器;外节基部一侧的细胞膜内陷折叠形成重叠排列的盘状结构即膜盘,结构清晰,排列整齐。模型1个月组:神经节细胞细胞结构紊乱，线粒体肿胀，细胞器水肿。细胞突起水肿，内丛状层及外丛状层轻微水肿，尤其以神经纤维层为明显。内核层未有明显变化。视杆细胞仅见膜盘局部模糊不清,结构紊乱,间隙略有扩大；模型3个月组:神经节细胞线粒体进一步肿胀，染色质开始出现边集。神经纤维层、内丛状层及外丛状层水肿不明显，局部细胞器结构紊乱，表现为局部萎缩改变。内核层细胞染色质向中央聚集,电子密度增加，胞质内线粒体肿胀。膜盘间隙进一步扩大,局部出现溶解、断裂,视杆内节线粒体明显肿胀,甚至出现空泡性变。模型6个月组:神经节细胞线粒体数目减少、肿胀，嵴变短、消失,髓样变性进一步明显,在神经节细胞层甚至可见暗细胞，即细胞核固缩,胞质密度高,粗面内质网扩大,核糖体解聚,节细胞的损害以大细胞为主。神经纤维层和内、外丛状层神经细胞突起萎缩，结构进一步紊乱，局部细胞器结构消失。内核层细胞核固缩，胞质线粒体水肿,嵴模糊不清,空泡增多,细胞间隙加大，6个月组中可见凋亡小体(图2)。视杆细胞膜盘内和膜盘间可出现空泡，结构紊乱。氨基胍1个月组:各层变化较轻微，仅见膜盘局部模糊、间隙略扩大。氨基胍3个月组:神经细胞出现结构紊乱，线粒体肿胀。内核层细胞染色质边集，线粒体肿胀。神经纤维层，内丛状层及外丛状层细胞突起改变较未治疗组轻。膜盘间隙增大,局部出现溶解、断裂,视杆内节线粒体偶见肿胀。氨基胍6个月组:神经细胞线粒体肿胀等改变较为明显，内核层细胞核异染色质边集较明显。线粒体水肿,嵴模糊,空泡增多。视杆细胞膜盘间隙增大,可见膜盘断裂、溶解,可出现空泡。但较同病程模型组大鼠病变程度明显减轻。
3 讨论
DM视网膜病变的发病是多因素、多阶段作用的结果以往的研究主要集中在视网膜新生血管方面。现在越来越多的证据表明凋亡与新生血管一样是DM视网膜病变发病机制的重要组成部分，在DM早期神经视网膜部分就有明显的凋亡改变，这些细胞的凋亡可加速DM视网膜微血管病变的发展和视网膜功能的异常。对75个月的DM大鼠视网膜组织进行图像分析，发现视网膜的内丛状层和内核层各自厚度减少了22%和14%，神经节细胞的数量与对照组减少了10%，TUNEL标记发现全层视网膜细胞凋亡增加了10倍〔2〕。 有研究发现在DM患者视网膜组织中出现神经节细胞的萎缩和内核层变性，并认为这种变性可能有助于血管改变的早期病变〔3〕。神经细胞的丢失提示了疾病的过程是不可逆的，因为这些细胞不能被普通的细胞替换，DM患者的视力只有发现一种避免视网膜神经细胞丢失的方法才能得到保护。
本文观察结果表明，DM视网膜病变过程中凋亡现象的存在，从而也证明DM视网膜病变的视力改变的原因不仅因为视网膜毛细血管的改变，其中神经细胞凋亡的原因也是不容忽视的主要原因。在DM早期出现视网膜神经细胞凋亡的可能机制：高血糖刺激可通过形成蛋白非酶糖基化终产物(AGEs)来影响细胞的正常生理功能。AGEs自身可直接引起细胞损害，还可引起自由基产生增加，自由基可破坏线粒体结构、干扰氧化磷酸化功能，促使三磷酸腺苷(ATP)生成减少，从而抑制钙泵的功能，引起细胞内钙超负荷。自由基的增多及钙内流可诱发Fas的表达，通过Fas/FasL激活caspase级联导致细胞凋亡〔4，5〕。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的一个瀑布式激活过程，而caspase家族是一切凋亡信号传导的共同通路。Caspase表示一组特异性天门冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶,均以无活性的酶原形式存在于胞浆中。Caspase的激活被认为是凋亡信号传递途径最后的共同通道，是细胞进入程序性死亡的特异性标志。 Caspase一经激活裂解其作用底物,细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段。其中Caspase3在caspase家族中属于凋亡效应亚类的蛋白酶,执行剪切细胞结构蛋白的作用,直接使细胞发生凋亡,是细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶。本实验研究发现，在模型3个月组，视网膜神经细胞就出现了caspase3的阳性表达。并且随着DM病程的进展表达增加。这个结果进一步证实了在DM早期视网膜神经细胞出现凋亡，并且caspase3参与了神经细胞的凋亡。
氨基胍是一种肼复合物，带有一个能与缺乏电子的羟基基团起反应的无毒亲核肼基团，肼能够使多种氧化还原酶失活。以往的研究证实，氨基胍的作用是多方面的。氨基胍能够阻断AGEs的生成：氨基胍上的氨基酸通过与早期糖化产物(Amadori产物)及3脱氧葡萄糖酮等含有活性羰基的Amadori降解产物发生反应，形成无活性的Amadori产物替代物，从而阻断早期糖化产物进一步重排脱氢形成AGEs。氨基胍还能与葡萄糖缩合反应形成一种醛，它在某些方面与羰基复合物类似，导致游离葡萄糖浓度的减少，从而抑制了糖化蛋白的产生。氨基胍能抑制视网膜血管壁AGEs的沉积以及AGEs和胶原蛋白、白蛋白等蛋白糖化后的交联形成。此外，氨基胍能够明显抑制白细胞黏附于毛细血管内皮细胞上,改善毛细血管的血流动力学,减少血管通透性、毛细血管闭塞程度,改善视网膜的缺氧状态。另外,氨基胍在清除体内自由基的毒性作用方面也起到了一定的效果〔6〕。本实验采用氨基胍治疗DM早期视网膜组织的改变，结果显示,氨基胍治疗组相对于模型组大鼠视网膜超微结构改变轻微、caspase3阳性细胞数明显减少，表明了氨基胍对DM视网膜病变有一定的防治作用。其可能的作用原理是氨基胍有效地抑制了早期糖化产物的形成，阻断早期糖化产物脱氢重排的发生,减少了AGEs的生成及其在组织中的沉积，从而进一步减少了自由基、乙二醛的生成及细胞钙内流，从而减少了caspase家族的表达，最终保护了细胞的正常生理功能。这可能是氨基胍治疗DM视网膜病变、抑制视网膜神经细胞凋亡的机制之一。
【参考文献】
1 Mizutani M，Kern TS，Lorenzi MAccelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy〔J〕J Clin Invest,1996;197(12):288390
2 Barber AJA new view of diabetic retinopathy:a neurodegenerative disease of the eye〔J〕Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2003;27(2):28390
3 Lieth E，Gardner TW，Barber AJ,et alRetinal neurodegeneration:early pathology in diabetes〔J〕Clin Experiment Ophthalmol，2000；28(1)：38
4 Kim J，Kim KS，Shinn JW,et alThe effect of antioxidants on glycated albumininduced cytotoxicity in bovine retinal pericytes〔J〕Biochem Biophys Res Commun，2002;292(4):10106
5 Yamagishi S，Amano S，Inagaki Y,et alBeraprost sodium，a prostaglandin i2 analogue，protects against advanced glycation end productsinduced injury in cultured retinal pericytes〔J〕Mol Med,2002;290(3):9738
6 Kern TS，Tang J，Mizutani M,et alResponse of capillary cell death to aminoguanidine predicts the development of retinopathy:comparison of diabetes and galactosemia〔J〕Invest Ophthalmol Vis Sci，2000;41(12):39728 上一页 [1] [2] |
