作者：陈舒怿 作者单位：（200233）中国上海市，上海交通大学附属第六人民医院眼科
【摘要】 探讨超顺磁性铁纳米颗粒（SPIO）标记对视网膜前体细胞体外培养的影响并对其进行量化,探求SPIO标记视网膜前体细胞的最佳浓度。方法：来源于19d胚胎大鼠的视网膜前体细胞，以不同浓度SPIO标记(Fe3+颗粒浓度为5.6，11.2，16.8，22.4mg/L)24～48h后，进行形态学观察和流式细胞技术、MTT和Turnel等技术分析，研究细胞增殖和凋亡情况。结果：当SPIO标记浓度低（<5.6mg/L）时，细胞生长不受影响但转染效率较低（<60%），无法满足MRI示踪的要求；浓度高(>22.4mg/L)时符合MRI示踪要求，但标记物对细胞产生毒性，影响其生长；浓度11.2～16.8mg/L时，既不影响细胞生长，也能达到较好的转染效率。结论：SPIO标记浓度在11.2～16.8mg/L范围内时为最佳，标记效率较高且不影响细胞的体外分化培养。
【关键词】 超顺磁性铁纳米颗粒 视网膜 干细胞
0引言
近年来，视网膜干细胞移植已经成为视神经变性和再生领域研究的热点之一，使以往认为无法治疗的理念得以更新[1]。但是，干细胞移植入体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的问题。MR示踪技术在解决细胞活体示踪的难题上是行之有效的，它有效成像时间长，可观察细胞的动态迁徙过程，且空间、时间分辨率高，对比度好[2]。超顺磁性铁纳米颗粒（SPIO）是近年来研究发现的新型磁共振阴性对比剂，可在活体标记神经干细胞[3]。Hoehn等[3]报道将SPIO标记神经干细胞移植入脑梗死模型大鼠脑内，用MRI可在活体上示踪移植到脑内的磁化标记神经干细胞。但是示踪剂的应用是否会对供体视网膜干细胞的分化生长产生影响呢？van den Bos等[4]发现，单纯使用SPIO标记细胞，使细胞内的自由基生成增加，会对细胞产生毒副作用。在该问题上，我们对示踪剂SPIO并转染剂，是否会对视网膜前体细胞体外分化产生影响展开研究，为SPIO 标记视网膜前体细胞体内移植的活体示踪提供前提条件。
1材料和方法
1.1材料
孕19d SD大鼠（由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供，符合中国实验动物标准），取其胚胎视网膜作为实验材料。流式细胞仪：FACSCalibur美国becton Dickinson 公司；激光工作条件：氩离子激光器Class111b 美国光谱物理公司；计算机数据处理软件：Cellquest软件BD公司；CM120透射电镜：PHILIP公司；Aneexin VFITC/PI 凋亡试剂盒Biovision公司；Tunel凋亡试剂盒cat#1584809美国Roch公司；Ferumoxides[(Fe2O3) (FeO) ，商品名Endorem，Resovist，Fefidex]（SPIO）由上海交通大学纳米研究所赠送。
1.2方法
无菌条件下取出胚胎鼠完整眼球，Hanks缓冲液冲洗3次，去除多余的组织及视神经，沿巩膜缘剪开眼球，除去眼前节（虹膜、晶状体等）、巩膜、脉络膜等，保留视网膜。使用微量移液器尖端将其打碎后，于EDTA胰酶37℃ 消化5min。吹打并使用40μmol／L过滤器获取单细胞。低速离心（800r/min）5min，于新鲜培养液（含DMEM/F12，10g/L N2，20μg/L bFGF，20μg/L EGF）中培养。细胞隔天半量换液，3～5d以1∶2比例传代。细胞传一代后，即改为含10mg/L胎牛血清及Ferumoxides（浓度分别为0，5.6，11.2，16.8，22.4mg/L）的上述培养液中分组培养，24～48h后细胞经PBS漂洗一次，改为含10g/L胎牛血清、不含Fe3+颗粒的培养液培养，并取小部分细胞进行普鲁士蓝染色观察铁颗粒标记是否成功，推测转染效率。
1.2.1电镜观察
分别收集对数期生长的各组细胞 1×106个，经戊二醛固定、常规制备，LKBI型超薄切片机切片50～60nm，30g/L醋酸铀枸橼酸铅双染色，于CM120透射电镜观察细胞标记情况及凋亡形态。
1.2.2凋亡检测
把不同浓度标记的细胞分设定为A，B，C，D四组，无标记细胞为O组。取各组对数期生长的细胞，每组分别进行原位末端标记法（Tunel）、Annexin V/PI检测凋亡细胞，并运用流式细胞仪对细胞进行周期检测，以及MTT法检测细胞的生长活性。
统计学处理：采用SPSS11.0软件进行统计学分析。
2结果
取材得到的原代视网膜前体细胞24h贴壁，呈球状分布（图1A），传代后细胞成簇分布。SPIO标记成功的细胞，普鲁士蓝染色呈亮蓝色（图1B）。对各组细胞每组取10个高倍视野至少1000个细胞进行计数，计算阳性细胞占总细胞的百分数，结果显示当SPIO标记浓度在5.6mg/L时，标记率小于60%；而当浓度大于等于11.2mg/L时，标记率均在90%以上水平。
2.1电镜检查结果
细胞经SPIO标记后，在细胞内形成含铁囊泡（图2A）。与未行SPIO标记的空白组（0mg/L）和低浓度SPIO标记组（5.6，11.2mg/L）比较，在SPIO高浓度标记细胞组（16.8，22.4mg/L）可观察到细胞的超微结构变化，如核固缩、细胞器溶解（图2B）等，表明SPIO标记在浓度小于16.8mg/L时并不影响视网膜前体细胞的生长。
2.2 Tunel检测的结果
细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，表明有细胞凋亡。对各组视网膜前体细胞每组取10个高倍视野至少1000个细胞进行计数，计算阳性凋亡细胞占中细胞的百分数（表1）由此可见，在SPIO标记浓度大于11.2mg/L后，细胞凋亡数量明显增多。
2.3流式细胞仪检测的结果
流式细胞技术Annexin V分析结果显示，视网膜前体细胞在SPIO标记浓度16.8，22.4mg/L时，凋亡细胞明显增加，与对照组相比，有统计学差异（P<0.05）。而在浓度（5.6，11.2mg/L）较低时则与空白组相仿，无统计学差异;细胞周期检测表明，视网膜前体细胞在SPIO标记浓度小于16.8mg/L时，细胞周期正常，死细胞较少；随着SPIO标记浓度的增加，周期发生改变，死细胞数明显增多。检测结果说明，视网膜前体细胞在SPIO标记浓度在5.6，11.2mg/L时，并不影响细胞的生长。而在更高浓度时，凋亡细胞数量随着标记浓度的增加而增加；而细胞周期随着标记浓度改变并不大。
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