作者：陈国玲，陈双，刘艳丽，巍璐婉，刘执玉 作者单位：1. 山东大学医学院解剖学教研室， 济南 250012； 2. 山东大学眼科中心 第二医院眼科， 济南 250033；3. 枣庄市山亭区人民医院， 山东 枣庄 277200
【摘要】 目的 研究脂多糖(LPS)诱导人角膜基质细胞核因子κBp65 (NFκBp65)和NFκB抑制因子α(IκBα)的表达及意义。方法 原代培养人眼角膜基质细胞，用免疫细胞化学SABC方法进行细胞鉴定。采用绿脓杆菌LPS刺激角膜基质细胞，分别于刺激前（0?h），刺激后1、2、4、8?h收集细胞。Western blot检测胞浆内IκBα蛋白及胞核内NFκBp65蛋白的表达。结果 与0?h相比，LPS刺激细胞1?h时，即可检测到胞核内NFκBp65蛋白表达增加，其电泳条带的光密度值随着刺激时间的延长而逐渐变亮，4?h表达最高。LPS刺激细胞后各时点的NFκBp65蛋白表达与0?h组比较，差异有统计学意义（P均＜0.01）。LPS刺激角膜基质细胞后，在各时间点均可引起胞浆IκBα表达下降，4?h?时表达最低（P均＜0.01）。结论 LPS可引起人眼角膜基质细胞IκBα的降解，促进NFκB的核转位，在角膜炎的过程中可能起一定的抗炎作用。
【关键词】 脂多糖；角膜基质；NFκB；NFκB抑制因子α
CHEN Guoling1，2， CHEN Shuang3， LIU Yanli1， WEI Luwan1, LIU Zhiyu1
(1. Department of Anatomy, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;
2. Ophthalmic Center of Shandong University, Department of Ophthalmology, Second Hospital of Shandong University,
Jinan 250033, China; 3. People′s Hospital of Shanting District， Zaozhuang 277200, Shandong, China)
To investigate expressions and significance of nuclear factorkappaB(NFκB) and inhibitor of NFκB (IκB)αinduced by lipopolysaccharide(LPS) in cultured human corneal fibroblasts. Methods Human corneal fibroblasts were primarily cultured and identified by the SABC method. Immunocytochemical staining with an antibody against Vimentin was performed to identify these cells. Cells were collected before being challenged with LPS and 1,2,4 and 8h after LPS treated, then protein expressions of NFκBp65 and IκBα were assessed by Western Blot analysis. Results Compared with the 0?h group, NFκBp65 level was significantly enhanced in the nucleus of human corneal fibroblasts after LPS challenge of 1 to 8?h(P＜0.01), the peak expression of NFκBp65 was observed at 4?h. However， the protein of the IκBα level was significantly decreased after LPS treatment at each point(P＜0.01). Conclusion These results suggest that LPS takes part in the degeneration of IκBα and mediates nuclear translocation of NFκB in cultured human corneal fibroblasts in vitro.
Key words： Lipopolysaccharide; Corneal stroma; Nuclear factorkappaB; Inhibitor of NFκBα 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌破裂后由细胞壁外膜释出的具有特殊结构的物质。LPS是诱发炎症反应的主要致病成分［1］。核因子κB (nuclear factorkappaB, NFκB)是广泛参与机体免疫、炎性反应、应激反应等生理病理过程的重要核转录因子，调控多种生长因子、粘附分子及细胞因子的表达［23］。本研究以绿脓杆菌LPS刺激人角膜基质细胞作为炎症细胞模型, 观察LPS刺激对角膜基质细胞NFκBp65、NFκB抑制因子α (inhibitor of NF κBα,IκBα)表达的影响，探讨其在角膜损害中的意义。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料 液体培养基（MEM）购自美国Hyclone公司；IκBα、NFκBp65和波形纤维蛋白(Vimentin) 一抗分别购自美国Neomarkers公司和Santa cruz公司；绿脓杆菌LPS为美国Sigma公司产品。细胞培养皿、培养瓶、离心管、培养板等培养用品系美国Costar公司产品。
1.2 取材和角膜基质细胞培养 无菌条件下取用于角膜移植术的健康供体角膜的剩余部分，采用角膜基质组织块培养法原代培养人眼角膜基质细胞。用含有10%胎牛血清的MEM培养基，于37?℃，5%CO2细胞孵育箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态。原代培养的角膜基质细胞生长至约80％融合后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞进行细胞传代。选取第4代角膜基质细胞用于本研究［4］，实验前换用无血清的MEM基础培养液，培养24?h，使细胞达到同步化。用绿脓杆菌LPS(终浓度10?μg/L）刺激角膜基质细胞，分别于刺激前(0?h)、刺激后1、2、4、8?h弃去细胞培养液，PBS冲洗两遍，离心、收集细胞备用。
1.3 角膜基质细胞的免疫细胞化学鉴定 将体外培养的角膜基质细胞进行传代培养（0.25％胰蛋白酶），将传代细胞传至平铺于六孔板底部的玻片上。细胞培养至80％融合时取出玻片，参照免疫细胞化学的试剂盒说明书进行操作。依次将玻片行PBS漂洗、4％多聚甲醛固定、3％BSA封闭后，分别加入一抗(Vimentin)、二抗、磷酸缓冲液漂洗等，最后DAB显色，显微镜下控制反应时间，蒸馏水冲洗终止反应，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。全自动显微照相机（日本Olympus公司）镜下观察并拍照。
1.4 Western blot检测人眼角膜基质细胞NFκBp65和IκBα蛋白的表达 4?℃下进行操作。参照试剂盒说明书分别提取体外培养的角膜基质细胞蛋白，考马斯亮蓝法（Bradford法）进行蛋白定量分析，备用。取等量的蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离后，电转膜方法将电泳产物转至硝酸纤维膜上，依次进行5%牛血清白蛋白封闭、加一抗、二抗，显色、终止反应等步骤。经全自动图象分析系统处理并分析硝酸纤维膜上的蛋白条带的光密度值，记录实验结果并进行统计学处理。
1.5 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行统计学处理，实验结果用±s表示，单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 角膜基质细胞的形态学特征及免疫细胞化学鉴定 见图1。倒置显微镜观察到角膜基质组织块接种后第4天，可见有细胞自组织块表层及周边爬出，刚长出的细胞多为梭形，也有的细胞呈三角形或多角形（图1A）。原代培养的角膜基质细胞培养到2周左右，细胞逐渐增多，轮廓趋于清晰，可见到核仁。角膜基质细胞渐渐密集，融合的细胞呈纤维细胞外观，排列呈螺旋状或漩涡状（图1B）。传代培养的角膜基质细胞增殖速度较原代细胞快。免疫细胞化学方法显示体外培养的角膜基质细胞Vimentin蛋白表达为阳性（图1C、D）。角膜基质细胞的形态学特征及免疫细胞化学观察
A: 角膜基质组织块接种后第4天，可见细胞自组织块爬出（×200）；B：融合的原代细胞排列成“漩涡"状（×100）；C:免疫细胞化学阴性对照（×400）；D: 角膜基质细胞的免疫细胞化学鉴定：培养细胞的波形纤维蛋白(Vimentin) 表达为阳性 (SABC×400)
2.2 LPS刺激对角膜基质细胞NFκBp65核转位的影响 见图2。 Western blot 结果显示：在绿脓杆菌LPS刺激体外培养的角膜基质细胞1?h时，细胞表达NFκBp65蛋白的水平较LPS刺激前（0?h）明显增加，图象扫描光密度值分别为73.608?3±5.130?2和26.723?3±3.344?9，(q＝19.898?6，P＜0.01），NFκBp65蛋白电泳条带的亮度及光密度值随刺激时间延长而逐渐升高，至4?h时，条带最亮，光密度值为162.970?0±7.077?2，为LPS刺激前（0?h）的6倍。8?h时，NFκBp65表达（109.703?3±5.546?7）较4?h时下降。角膜基质细胞表达NFκBp65蛋白的水平在LPS刺激后各时点均较0?h组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。
2.3 LPS刺激对角膜基质细胞IκBα表达的影响 见图3。用绿脓杆菌LPS刺激体外培养的角膜基质细胞1?h时，细胞表达IκBα蛋白的水平较LPS刺激前（0?h）明显下降，且随刺激时间延长而逐渐下降，刺激角膜基质细胞4?h时，IκBα表达水平达最低(光密度值为19.325?1±2.625?8)，仅为LPS刺激前（0?h）的1/3（q＝31.580?7，P＜0.01），条带光密度值的结果显示角膜基质细胞IκBα蛋白表达的下降有时间依赖性, LPS刺激细胞后各时点IκBα蛋白的表达较LPS刺激前（0?h）明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。由于IκBα是NFκB的抑制性单位，其表达水平下降代表NFκB的活化,本结果表明，LPS可诱导角膜基质细胞NFκB活化。
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