作者：姜河，卿素珠，金岩，孟浩，张锐红，成醒民 作者单位：1. 西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌 712100；2.第四军医大学组织工程研发中心，陕西西安 710032；3.陕西澄城县畜牧中心，陕西澄城 715200
【摘要】 目的 寻找有效适宜的脱细胞方法对猪角膜进行处理,制备角膜生物支架材料。方法 利用胰酶和胶原酶消化结合液氮冻融的方法对猪角膜基质进行处理，60Co消毒，冻干保存。经组织学观察、细胞培养附和与动物移植检验其生物特性。结果 获得的脱细胞角膜基质，显微结构观察显示板层结构完整，胶原纤维间组织结构疏松，未见细胞残留，整个基质成网状结构，在上皮面保存有完整连续的基底膜。细胞培养附和实验观察到种子细胞可以在基质上良好生长。动物移植实验未见明显的炎症反应与排斥。结论 经该法脱细胞处理后得到的角膜基质无细胞毒性，组织相容性好，可以成为适宜的组织工程支架材料。
【关键词】 角膜；脱细胞基质；组织相容性；猪；家兔
基金项目：“863计划”组织器官工程重大项目基金资助(No.2002AA205041，2005AA205241)
Experimental study on preparation of acellular corneal stroma and its compatibility
Jiang He, Qing Suzhu, Jin Yan, Meng Hao, Zhang Ruihong, Cheng Xingmin
1. College of Animal Science of Northwest Agriculture & Forest Science andTechnology University, Yangling 712100;
2. Tissue Engineering Center of the Fourth Military Medical University, Xian 710032;
3. Animal Husbandry Center of Chengcheng Country, Chengcheng 715200, China
ABSTRACT: Objective To investigate an effective and compatible way to obtain acellular cornea, which should be a suitable scaffold for construction of tissue engineering cornea. Methods Fresh cornea of swine were treated by taking enzyme digestion combined with frozen in liquid nitrogen and then thawed. Collected after the process, swine cornea became acellular stroma. Treated cornea were sterilized with 60Co and preserved in plastic bags after a freezedrying process. Histologic examination, seed cell compatibility and transplantation to the rabbit were performed to assess biocompatibility. Results Histologic diagnostic results showed no cell residues. Collagen fibers were arranged in a loose fashion, and lamina structure resembled that of the normal. It had complete continual epithelium basement membrane and seed cells could be cultured well on it. No rejection was observed after transplantation onto the surface of the rabbits eye for months. Conclusion Acellular corneal stroma prepared by this method has a good biocompatibility and atoxity for cells. Results of the experiment indicate that this method can be a suitable tissue engineering scaffold for cornea.
KEY WORDS: cornea; acellular matrix; compatibility; swine; rabbit
目前已广泛应用于临床的组织工程化材料涉及骨科、神经外科、心内科等领域，但在眼科较少，尤其是在眼表重建中大部分材料还停留在动物试验阶段[1]。近年来组织工程眼角膜的研究发展较快，其作为支架的生物材料可选择性也较大，但这些生物材料的特性如强度、韧性、生物相容性和降解速率等方面都存在不足，因此研究者们一直在寻找新型的支架材料[2]。脱去细胞后的角膜基质由Ⅰ和Ⅳ型胶原组成，胶原本身的免疫原性很低[3]，且具有角膜本身的物理性能如弹性、韧性、亲水性和抗拉力，生物相容性很好[47]。其作为组织工程支架材料，微观结构适宜种子细胞生长[4,8]，支架降解速率与植入种子细胞生长分化、组织改建速率相匹配，在支架完成为角膜组织提供模板功能后可被完全降解吸收或与新生组织融合[56,9]。完整的角膜基质由于其组织结构和物理质地与在体角膜相似，可为种子细胞的生长和分化营造适宜的微环境，诱导调节细胞的生长、增殖和分化[10]。本实验旨在探讨新的脱细胞角膜基质的制备方法，为达成理想的组织工程角膜支架材料提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜猪眼球100个，用三蒸水清洗，去除表面污物与血迹。将角膜全层剪下，去除虹膜组织，用含青链霉素的PBS液再次冲洗，5min×3次。
1.2 药品与试剂
2.5g/L胰蛋白酶(Gibco公司)，DNA酶(Sigma公司)，青霉素、链霉素、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，DMEM/F12(1∶1，V/V，Gibco公司)，速眠新Ⅱ注射液(长春解放军军需大学兽医研究所)，丁卡因等。
1.3 支架材料制备
将带巩膜环的角膜组织取下后，浸入三蒸水中，使角膜肿胀。倒掉液体，将角膜夹在两片载玻片之间，用锋利的刀片进行板层剖切，将角膜一分为二，取带上皮面的角膜，放入2.5g/L的胰酶中，37℃水浴1-2h。取出角膜，三蒸水反复清洗直至角膜片颜色由粉红色变略白。用纱布包裹将水分吸去。注意不可用力挤捏，以免破坏基质结构。将角膜放进液氮冻15min，取出，37℃水浴解冻。重复3次。用40u/mL DNA酶，37℃水浴，消化冻融后的角膜材料60min，用PBS液清洗数次。而后以三蒸水浸泡5h并震荡数次，将已经溶解掉的细胞碎片彻底洗出。真空冻干。塑料带封装，60Co消毒备用。这样得到的脱细胞角膜基质即为组织工程角膜的支架材料，石蜡切片HE染色观察结构特点，对支架断层进行扫描电镜观察。
1.4 细胞附和与动物移植实验
1.4.1 支架材料准备
将冻干的支架材料浸入DMEM进行复水。整个过程无菌操作。
1.4.2 骨髓间充质细胞培养及附和
取5日龄家兔，脱颈处死后取其四肢长骨，剪断两端，PBS冲洗骨髓腔，收集冲洗液，100目细胞筛过滤，加入培养基DMEM/F12后离心，收集细胞进入培养瓶，DMEM/F12作为基础培养基，加100mL/L的胎牛血清。每48h换液。收集第二代的贴壁细胞进行接种。接种前将支架材料浸入DMEM/F12中24h。将细胞悬液均匀的滴加在支架的上皮面与基质面，用钢丝支架悬空支架材料，防止与培养板底部接触。放入培养箱静置2-3h，然后沿培养板壁缓缓加入培养液。每48h换液。9d后做石蜡切片，HE染色观察。
1.4.3 板层角膜移植
根据屈雷等方法[11]制作家兔角膜病变。术前眼角膜浑浊，瞳孔不可视，角膜表面血管化情况严重，毛细血管覆盖角膜2/3面积。速眠新注射液肌注0.1mL/kg，丁卡因点眼，按照常规手术方案进行角膜板层移植手术。首先剥离角膜表层的浑浊和增生血管组织，创造平整、光滑、透明的植床。根据植床面积裁取合适大小的无细胞支架材料，将其平铺在植床上，边缘连续缝合使材料与植床贴合紧密。术后每日用生理盐水冲洗眼表和眼睑，庆大霉素点眼。
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