|
2 结 果
2.1 支架观察
眼观冻干支架材料呈白色疏松片状形态，厚约1-2mm。DMEM复水3h后呈半透明且与正常角膜韧性和强度相近，厚度约1mm，由于培养基的浸润而呈粉红色(图1A)。石蜡切片HE染色，光镜下可见角膜上皮与基质细胞脱除完全，无细胞和细胞碎屑残留，上皮基底膜完整，胶原纤维无断裂，结构疏松，整体成网状结构(图1B)。扫描电镜观察可见脱细胞基质胶原板层结构完整，材料呈三维立体网格状结构(图1C)。
2.2 细胞培养与附和观察结果
骨髓间充质细胞原代培养第4天，即可见大量成纤维样细胞密集生长，镜下观察成旋涡状，6d可以传代(图1D)。骨髓间充质细胞在支架上能够紧密贴附，生长状态良好。培养第9天，切片观察到骨髓间充质细胞在支架表面形成复层，支架内部未有细胞长入(图1E)。基质面接种细胞未见存活。扫描电镜观察到细胞密集生长在上皮基底膜表面并分泌胞外基质，依然是成纤维样细胞(图1F)。
2.3 动物移植实验
术前兔眼血管化情况严重，角膜浑浊不透明(图2A)，全角膜板层剖切病变角膜，暴露透明的角膜(图2B)，单纯材料覆盖并缝合在全角膜范围的植床(图2C)。术后2d支架与眼表组织贴合紧密，眼表湿润，光滑，无炎症反应(图2D)。角膜略有水肿，7d后水肿消退。15d后已逐渐透明，缝线处略有少量血管增生，位置局限于角巩缘1/3。取15d材料的组织学观察显示，支架与眼表自身组织紧密融合，材料与活体组织相容性良好。支架内部有少量炎性细胞浸润，基质细胞有长入支架内部的趋势，支架表面被上皮细胞覆盖，角膜整体生长良好。无血管化现象(图2E、F)。
3 讨 论
利用羊膜做为载体进行组织工程角膜的构建是角膜组织工程构建中常采用的方法。羊膜具有透明性、无抗原性、可促使上皮黏附、生长、分化，抑制炎症、新生血管、纤维化等特性，被认为是工程化角膜上皮的最佳载体[1214]。但在我们的研究过程中发现，羊膜本身的厚度较薄，无法适应于复杂的角膜移植如穿透性移植和眼压较高的病例。因此有必要进行新型角膜支架材料的探索。根据最新的研究报道[15]，作为干细胞的种子细胞其增殖分化不仅仅依赖于特定的细胞因子，很大程度上也和其存在的微环境以及生长基质的物理特性有很大关系。同时，脱去细胞成分的角膜基质免疫原性小，物理特性接近正常角膜，其临床应用范围比羊膜大。因此，脱细胞的天然角膜基质将会成为理想的组织工程支架材料。
文献[7，16]报道使用Triton进行脱细胞处理制备角膜支架材料。经实践发现该方法处理得到的脱细胞角膜基质虽然结构完整，细胞成分脱除彻底，但是种子细胞在该支架上往往生长不良，甚至无法生长。怀疑为残留Triton的细胞毒性作用导致细胞死亡。因此在接种细胞之前应尽量洗净残留在基质上的毒性物质。
本实验中对脱细胞基质双面进行细胞接种，但是只有上皮基底膜上的种子细胞才能良好生长，而基质面无基底膜的一侧几乎无细胞生长或在生长中死亡，因此推断上皮基底膜对于上皮细胞的支持是非常必要的。其原因还有待研究。
本实验结合物理和化学两种方法完全脱除角膜基质中的细胞成分，但不破坏胶原板层结构，其过程对酶浓度、消化温度和时间的要求是非常严格的。应用本方法制作的角膜支架材料结构完整，生物特性适合种子细胞生长，动物移植实验未见明显排斥反应和血管化现象，是比较合适的角膜组织工程支架。
【参考文献】
[1]王涛. 组织工程材料在眼表重建中的应用 [J]. 眼科新进展, 2006, 26(12):951954.
[2]杨志明译.组织工程原理 [M]. 第一版.北京：化学工业出版社, 2006:449463.
[3]王智崇,葛坚,徐锦堂，等. 角膜不同组织免疫原性分析 [J]. 中华眼科杂志, 2002, 38(9):535538.
[4]张超，胡丹，金岩. 组织工程角膜基质的体外构建及移植实验研究 [J]. 眼科新进展, 2006, 26(11):805809.
[5]张超，金岩，刘建民，等. 异种脱细胞角膜基质材料的生物相容性研究 [J]. 国际眼科杂志, 2005, 5(2):250252.
[6]聂鑫，金岩，张超，等. 异种脱细胞角膜基质囊袋移植的生物相容性研究 [J]. 生物医学工程与临床, 2005, 9(5):264266.
[7]陈苹，傅瑶，范先群. 猪角膜脱细胞基质的制备及生物相容性的实验研究 [J]. 眼科研究, 2006, 24(4):367370.
[8]刘德伍，邹萍. 脱细胞角膜基质与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化活性人工角膜 [J]. 中国临床康复, 2006, 10(25):5456.
[9]傅瑶，陈苹，范先群. 异种脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较 [J]. 眼科研究, 2006, 24(6):561564.
[10]王智崇，葛坚，陈家祺，等. 角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究 [J]. 眼科学报, 1999, 15(4):195198.
[11]屈雷，杨学义，王馨，等. 家兔角膜缘干细胞缺损病理模型的制作 [J]. 西北农林科技大学学报, 2004, 32(9):6165.
[12]魏春惠，孙建宁，栾洁，等. 新鲜羊膜移植治疗兔角膜碱烧伤的光镜和电镜观察 [J]. 眼科新进展, 2007, 27(1):3740.
[13]屈雷，王馨，杨学义，等. 构建组织工程化羊膜角膜上皮植片的研究进展 [J]. 国际眼科杂志, 2004, 4(1):115120.
[14]Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, et al. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42(7):15391546.
[15]Adam JE, Shamik S, Sweeney HL, et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification [J]. Cell, 2006, 126(25):677689.
[16]张超，金岩, 聂鑫，等. 组织工程角膜生物材料载体制备的比较性研究 [J]. 中国修复重建外科杂志, 2006, 20(2):185188. 上一页 [1] [2] |
