2.3  SEB抑制受体T淋巴细胞的应答反应能力（DTH） 

　　选择移植片存活时间最长的75μg/kg组和移植对照组大鼠在接受角膜移植后的第10天做迟发性过敏反应实验（DTH）。表3的结果显示对照组和75μg/kg组0h和24h脚掌厚度，经DTH脚掌膨胀度计算，对照组为84.6×10-3mm, SEB75μg/kg组为12.5×10-3mm，实验组T细胞的应答反应能力明显降低。

　　表2  受体淋巴细胞对ConA 和供体脾细胞的应（略）

　　注：与移植对照组相比，★P≤0.01

　　表3  SEB75μg/kg组和对照组DTH反应强度的比较（略）

　　经计算对照组脚掌膨胀度为84.6×10-3mm，SEB75μg/kg组为：12.5×10-3mm。

　　2.4  SEB对受体鼠淋巴细胞亚群的影响 

　　角膜移植术后第10天，用流式细胞技术测定各组大鼠脾细胞、下颌腺淋巴细胞中CD4+T、CD8+T和CD4+CD16+NKT细胞的百分数。结果显示移植前后使用SEB50、75μg/kg的大鼠外周组织中CD4+T、CD8+T细胞数量减少；CD4+CD16+NKT细胞的数量随CD4+T、CD8+T细胞数量的减少而增加（见表4）。

　　表4  受体外周器官淋巴细胞亚群构成比（略）

　　注：与移植对照组相比，★P≤0.01，recipients(n=2)

　　2.5  NKT细胞参与SEB诱导的抗排斥作用 

　　在角膜移植中使用50μg/kg SEB的同时结膜下注射0.1ml地塞米松(2.0mg/ml)。结果显示单独使用SEB可以延长移植片存活时间2～3天，大鼠的脾、下颌腺和外周血中NKT细胞数量大幅增加；使用地塞米松后，SEB的抗排斥作用消失，NKT细胞数量明显减少到低于正常组（见表5）。

　　2.6  SEB对受体鼠代谢产物的影响 

　　用ELISA方法检查术后第10天各组大鼠房水和血清中IL-2和IL-10水平，结果显示出与对照组大鼠相比，SEB实验组大鼠的IL-2水平明显降低，IL-10水平明显增加。其中抗排斥能力最好的SEB75μg/kg组大鼠的IL-2水平低于对照组约4倍，IL-10水平高于对照组约2倍以上（见表6）。

　　表5  NKT细胞百分数与移植片存活天数比较（略）

　　表6  受体组大鼠房水和血清中细胞因子的浓度(pg/ml)（略）

　　注：与移植对照组相比，★P≤0.01

　　3  讨论

　　NKT细胞是一群表达NK1.1+TcRαβ+抗原的淋巴细胞亚群，最初是在那些NK1.1+的小鼠中发现,2000年被命名为第四类的淋巴细胞。小鼠的NKT细胞主要是CD4+或者CD4-、CD8-细胞［1、7］。大量的NKT细胞存在于肝脏，大约占T淋巴细胞的30%，外周血、脾脏中很少只占2%前后［8］ 。NKT细胞的作用主要有两个方面，效应功能和调节功能；它可以抑制Th1细胞的过激，控制IL-2、IFN-γ的产生和后期的细胞增殖，可以调节Th2细胞的细胞因子产生，使T细胞分化朝Th2方向偏移；它也可以在Th1细胞抵抗感染和肿瘤时提供帮助以及可以阻止部分细胞的分化，控制自身免疫病的发生和发展［9］。NKT细胞的活化主要依靠类脂多肽类抗原如半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,简称α-galcer）和类似于MHC I类抗原的CD1d递呈抗原。目前还无法证明其他脂类或糖脂类抗原能否激活NKT细胞，并使其发挥功能。笔者以往的研究发现葡萄球菌肠毒素B（SEB）作为耐受原不仅能诱导淋巴细胞的耐受［4］ ，在异基因骨髓移植、皮肤移植和角膜移植中都显示出明显抗排斥效应［10、11］ ，而所有耐受特征和抗排斥作用都伴随NKT细胞的增加。尽管在角膜移植中使用SEB能使角膜移植片成功存活25天以上［5］ ，但是因为角膜是赦免部位（immune privileged site），它们通常与免疫系统隔离，角膜移植中由于角膜缺乏血管和淋巴管，淋巴细胞不易进入角膜，因此不易发生排斥反应，是成功率最高的器官移植。如果眼屏障被打破，淋巴细胞就可以进入眼内，排斥反应将加剧。为了研究SEB在高危角膜移植中的抗排斥效应和耐受形成中NKT细胞的重要作用，本文使用了角膜移植前用缝线法处理成血管增生的高危状态的大鼠，在遗传背景不同的大鼠间进行角膜移植的前后给受体鼠腹腔注射了25μg、50μg、75μg 和100μg /kg SEB并检查了SEB诱导的抗排斥作用和耐受形成的细胞学特征。这些结果显示，在角膜移植中使用适量的SEB（ 50ug、75μg/kg）可以使移植片的存活时间延长到10.70天到12.5天，比移植对照组长3～5天（P≤0.05，表1）。用这些获得了抗排斥能力的受体鼠的淋巴细胞与ConA或同种异体大鼠的淋巴细胞反应，其应答反应能力下降，A值分别由1.51下降到0.64和从0.83下降到0.47（表2）；与对照组相比，迟发型过敏反应（DTH）能力降低了约8倍（表3）。DTH反应性降低通常与角膜移植片长期存活和眼前房免疫偏位（anterior chamber-associated immuned deviation, ACAID）有关；ACAID是显示动物外周免疫系统耐受的指标，它破坏Th1细胞的应答反应，介导向Th2细胞偏移［12］。另外，在具有抗排斥能力的受体鼠中，随移植片存活时间的延长，CD4+T、CD8+T细胞数量减少， CD4+CD16+NKT细胞数量在脾脏和下颌腺中明显增加（表4，P≤0.05）,显示出SEB诱导的抗排斥作用与NKT细胞的大量存在有关。为了证明SEB活化的NKT细胞参与了SEB诱导的抗排斥作用，在角膜移植时同时使用地塞米松和SEB。表5的结果证明单独使用SEB可以使移植片存活时间延长并伴随CD4+CD16+NKT细胞的大幅增加；但地塞米松和SEB同时使用后，移植片不能存活，CD4+CD16+NKT细胞数量也明显低于正常值（表5）。这个结果表明能够活化NKT细胞的抗原除了α-galcer，SEB同样能够活化NKT细胞；活化了的NKT细胞具有生物功能，它们参与了机体的耐受性调节并在角膜移植中起到了抗排斥作用。SEB活化的NKT细胞是CD4+NKT细胞而不是CD4-NKT细胞［13，14］，因为它们分泌大量的IL-10 （表6）并很有可能介导了细胞向Th2细胞偏移。

　　本研究证明了SEB在高危角膜移植中诱导的抗排斥作用与NKT细胞的参与有关；并且证明了能够活化NKT细胞的抗原不限于α-galcer，SEB同样诱导出大量的CD4+CD16+NKT细胞。这些NKT细胞直接参与了SEB诱导抗排斥作用和耐受性调节，并有可能参与了促进了T细胞朝Th2细胞分化的过程。

　　【参考文献】

　　1  Taniguchi M.  A novel lymphocyte―NKT.  JSI Newsletter, 2000,8(1):15-16.

　　2  Seino KI, Fukao K, Muramoto K, et al. Requirement fot natural killer T(NKT) cells in the induction of allograft tolerance.  Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98:2577.

　　3  Smyth MJ, Godfrey DI. NKT cell and tumor immunity-a double-edged sword.  Nat Immunol, 2000,1:459.

　　4  陈钰，彭虹，尉承泽，等.超抗原SEB在同种异体细胞移植小鼠中诱导的免疫耐受极其特征.细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：101-103.

　　5  Zhiqiang Pan, Yu Chen, Wenhua Zhang, et al. Rat corneal allograft survival proloned by the superantigen staphylococcal enterotoxin B.  Invest Ophtbalmol Vis Sci， 2003,44:3346.

　　6  Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal tranplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis. Sci， 1985,26:23-30.

　　7  Macdonald HR. NK1.1+T cell receptor-α/β+cells: New clues to their origin, spicifity,and function. J Exp Med， 1995,182:633.

　　8  Luc Van Laer. Regulation of immune responses by CD1d-restricted nature killer T cells.  Immunologic Research， 2004,30(2):139-153.

　　9  Lucis B, Veronique L, Jan N, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the development of pathogenic T cells specific for pancreatic βcells.
Immunity,2002,17:725-736.

　　10  接英，潘志强，陈钰，等.SEB诱导的免疫耐受治疗大鼠高危角膜移植的实验研究.中华眼科杂志，2005， 41(2):150-155.

　　11  陈钰，潘志强，彭虹，等.在小鼠异基因骨髓细胞移植中超抗原SEB诱导的耐受特征.细胞与分子免疫学杂志，2005， 21（5）：544-547.

　　12  Nakamura T, Terajewicz A, Stein-Streilein J. Mechanisms of Peripheral Tolerance following Intracameral Inoculation Are Independent of IL-13 or STAT6. J Immunol，2005，Aug15;175(4):2643-2646.

　　13  Sonoda KH, Stein-streilein J. Ocular immune privilege and CD1d-reative natural killer T cells. Cornea, 2002,21(2):33-38.

　　14  中村隆彦，园田康平,石桥达朗，等.ACAID诱导には通常のCD4阳性NKT细胞でなくCD4阳性NKT胞が必须である.Proceedings of the Japanese Society for Immunology(JSI), 2004，34:135.

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30271385）

　　作者单位：  100853 北京，解放军总医院免疫学教研室

　　　　　　　100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院，北京同仁医院眼科中心，北京眼科研究所

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