作者：朱其新，余沃莲
摘要:目的 探讨聚合酶链反应（PCR）技术诊断单纯疱疹（单疱）病毒性角膜炎的实用价值，为临床诊断提供依据和方法。 方法 应用PCR技术对60例按临床诊断标准诊断为单疱病毒性角膜炎患者的患眼泪液及角膜上皮进行病毒DNA检测。 结果 PCR检测60例患者标本结果，阳性46例占76.7%，阴性14例占23.3%。 结论 对单疱病毒性角膜炎诊断不能只根据其临床特征来诊断;PCR可为临床提供实验诊断依据。
关键词:单疱病毒;角膜炎;泪液和角膜上皮;聚合酶链反应（PCR）
Diagnosis of herpes simplex keratitis by using PCR.
ZHUQi-xin，YU Wo-lian.
（Zhaoqing Municipal Second People's Hospital，Zhaoqing526060，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To detect herpes simplex virus（HSV）in tear and corneal epithelium of patients with herpes simlex ker-atitis（HSK）. Methods Tear and corneal epithelium of60cases clinically diagnosed as HSKwere tested by polymerase chain re-action（including24cases of punctate keratopathy，29cases of map keratopathy and7cases of disciform keratopathy）. Results The result was positive in46cases（76.7%）and negative in14（23.3%）. Conclusion Polymerase chain reaction is an experi-mental approach to diagnose HSK.
Key words:Herpes simplex virus;Keratitis;Tears and corneal epithelium;Polymerase chain reaction（PCR）
单纯疱疹（单疱）病毒性角膜炎（HSK）是常见的角膜病，近年发病率有上升趋势，以往对HSK的诊断，特别是基层医院的临床医生只根据HSK的临床特征来诊断，缺少实验诊断依据，容易造成误诊。因此，寻找一种快速、特异、灵敏的检测方法作实验诊断是非常必要的。我们自引进聚合酶链反应（PCR）技术后，应用它对60例临床诊断为HSK的患眼泪液及角膜上皮进行单疱病毒Ⅰ型（HSV-1）DNA检测，结果如下。
1 材料和方法
1.1 病例 按HSK临床诊断标准 ［1］ 选择60例临床诊断为HSK患者，其中点状角膜病变24例，树枝地图状角膜病变29例，盘状角膜病变7例;男性36例，女性24例;年龄在7～72岁之间;病程3d～10个月。
1.2 标本采集 经氨水刺激鼻腔后用钝针抽取患眼0.1～0.2ml泪液，同时用0.5%地卡因点眼作表麻，用安全刀刮取少许角膜病变上皮。将采集标本置于含1ml无菌生理盐水的试管中。
1.3 仪器和试剂 9600型扩增仪为厦门Amplly生产;单纯疱疹病毒Ⅰ型PCR荧光检测试剂盒。
1.4 PCR检测方法 按试剂盒说明操作。将采集标本在漩涡上振荡60s后收集在1.5ml离心管中，15000r/min离心10min，弃上清，沉淀加上50μl裂解液充分振荡混匀，100℃煮沸15min，15000r/min离心1min后，取上清5μl进行聚合酶反应检测。于9600型基因扩增仪配套上机管中加入双蒸水10μl、聚合酶链反应液5μl进行、待测标本5μl并阴、阳性对照同时进行。上述液体混匀后在基因扩增仪上首先94℃变性3min。然后按94℃变性60s，55℃退火60s为一循环，共35个循环。最后72℃终延伸5min。取10μl扩增产物，加入3μl溴酚兰载样液混匀后，点样于1%琼脂糖凝胶板，在1×TPE缓冲液中，70V电压电泳60min，溴化乙锭（EB）染色15～30min，双蒸水漂后于紫外光灯下观察结果。标本泳道中位于溴酚兰后有一条黄亮带与阳性对照黄亮带处于同一水平线位置者为阳性结果，无者为阴性结果。
2 结果
临床诊断60例患者PCR检出阳性46例，阳性率76.7%;阴性14例占23.3%。其中24例点状角膜病变者阳性18例，阳性率75%;29例树枝地图状角膜病变者阳性24例，阳性率82.75%;7例盘状角膜病变者阳性4例，阳性率57.14%。
3 讨论
HSK是角膜病中致盲率很高的感染性眼病。以往对感染病毒性疾病的实验检查一般是作病毒分离培养，但是这要求实验设备条件高，操作复杂，时间长，一般医院特别是基层医院无法开展。对HSK的诊断而言，临床医生特别是基层医院的临床医生只是根据HSK临床特征来诊断。由于近年来激素及免疫制剂的广泛应用，使HSK的角膜病变不典型，临床表现复杂，容易与其它感染性眼病相混淆，临床中仅凭病变形态和临床经验诊断容易造成误诊。PCR技术的临床应用对感染病毒性疾病的诊断是一个新突破，PCR技术是DNA体外扩增技术，可以在几小时内将任何希望扩增的极其微量的目的基因或DNA片断成百万倍地扩增，方法检测病毒DNA基因具有特异性强、灵敏度高、快速、无放射性污染等优点。目前研究证实HSV不仅存在于三叉神经节 ［3］ ，而且还存在于角膜及泪液而引起角膜病变，据此我们采取患眼泪液及病变角膜上皮进行HSV 1 -DNA PCR检测，以便获知患眼中是否存在HSV，结果可为临床提供病原学诊断依据，防止临床医生误诊、漏诊，为及时有效进行治疗提供依据。
PCR最具有实用价值的优势是灵敏度高、特异性强和快速。本组对60例临床诊断为HSK的患者，经PCR检测其患眼的泪液及角膜上皮中HSV-1DNA，阳性46例占76.7%，阴性14例占23.3%。据可靠文献 ［3］ 认定，PCR检测HSV-1DNA的特异性为100%，无假阳性，也无假阴性。说明本结果是可信、可靠的，也说明临床诊断误诊率为23.3%，说明了在HSK的诊断中不能只根据其临床特征来诊断。PCR技术检测可为临床诊断提供可靠的实验诊断依据，纠正临床上的误诊，防止治疗上盲目用药。在检测速度方面，常规病毒分离培养，不但需要较复杂的设备，时间至少需要1周甚至数周，而PCR只需数小时就可出结果;而且PCR灵敏度高，只要有微量的被检病原体存在，就能检出。PCR对HSK早期明确诊断后启示临床医生进行及时有效治疗，有助减轻患者痛苦，节省医疗资源。PCR技术设备虽需近10万元的投入，但除少数较穷困基层医院外，多数县级以上医院是可以投入也能开展的。因此，应用PCR技术不仅对HSK的诊断快速提供准确依据，而且还可应用于其他有关疾病的实验诊断，值得在基层医院推广。
参考文献:
［1］朱志忠.角膜病学［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，1986，94.
［2］杜鹃，徐杰，孙百鸣.多聚合酶链反应对单疱病毒性角膜炎泪液HSV DNA的检测［J］.中国实用眼科杂志，1998，16（2）:98～99.
［3］李影林.中华医学检验全书（下卷）［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，1996，1925. |
