作者：周玲芬
［摘要］目的探讨突触素（synaptophysin，SYN）在糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）发病中的作用。方法Sprague-Dawley雄性大鼠尾静脉注射链脲佐菌素造模，以血糖测定和尿糖水平测定进行筛选，正常对照组尾静脉注射等量枸橼酸钠缓冲液。成模后继续饲养4周，取出眼球视网膜组织，连续冰冻切片，用免疫组织化学SABC法染色观察各组大鼠视网膜SYN的表达情况。结果糖尿病大鼠成模前，两组动物的体重、血糖和尿糖检测结果间差异无统计学意义（P>0.05）。成模后4周，糖尿病组与正常组大鼠体重、血糖和尿糖分别为:（189.13±18.41）g，（23.72±3.25）mmol/L，（++至+++）和（260.52±32.15）g，（4.95±0.52）mmol/L，（-），两组差异有统计学意义（P<0.01）。SYN在正常组大鼠视网膜节细胞层及内核层均有表达，正常组大鼠视网膜SYN的光密度值为96.31±15.34。糖尿病大鼠视网膜内SYN表达显著减弱，糖尿病大鼠视网膜SYN的光密度值为65.73±8.92。两组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 SYN随糖尿病大鼠病程延长、病情加重，表达量减少。其表达量的变化很可能是DR发生、发展的重要因素。
［关键词］突触素;糖尿病视网膜病变;免疫组织化学;大鼠
Study on the possible role of synaptophysin in the pathophysiology of diabetic retinopathy
ZHOULingfen.
The Ophthalmology Department，The Second Hospital of Shaoxing，Shaoxing312000，China
【Abstract】 Objective To explore the possible role of Synaptophysin（SYN）in the pathophysiology of diabetic retinopathy.Methods Streptozotocin（STZ）-induced diabetic rats and normal rats were employed to study the al-teration of the SYN in the retina of diabetics by immunohistochemistry.The weight，blood sugar and urine sugarwere also measured before and after model induction in both groups.Results The data of weight，blood sugar and urine sugar indicated no significant difference between the two groups before animal model induction.Four weeks after the induction of diabetes，the differences between the control and the diabetic group in weight，blood sugar and urine sugar were dis-tinct（P<0.01）.When compared with the normal retina，a significant decrease of SYN expression was observed in the diabetic rats'retina（P<0.01）.Conclusions Experimental evidence showed down-regulation of SYN expression in retina of streptozotocin-induced diabetic rats under hyperglycemia condition，and it might play a role in the patho-physiology of diabetic retinopathy.
【Key words】synaptophysin;diabetic retinopathy;immunohistochemistry;rats
糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成为一种常见病，其患病率呈上升趋势，在发展中国家尤为突出 ［1］ 。而且年龄增长是增加糖尿病患病率的独立危险因素，全球正步入老龄化。如何提高老龄人口的生活质量也就倍受关注。糖尿病视网膜病（DR）是DM患者最为常见和严重的并发症之一，亦是目前世界上四大主要致盲疾病之一，但其发病机制至今尚未完全阐明 ［2］ 。高血糖、蛋白质的非酶糖基化、多元醇通路异常、血流动力 学异常、氧自由基的形成、各种血管增殖因子等都与DR的发生有关。近年来，越来越多的研究表明突触素（synaptophysin，SYN）参与了DM的发生和发展 ［3］ 。本实验旨在检测SYN在糖尿病大鼠视网膜中的表达情况，探讨其在DR发生、发展中的作用，从而为治疗视网膜变性疾病寻找到新的方法。
1材料和方法
1.1材料 实验选用浙江大学实验动物中心培育的Sprague―Dawley雄性大鼠20只，体重200～300g，年龄6个月左右;链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ） （S0130，由Sigma公司生产）;Lifescan血糖仪L9146、尿糖试纸（由广州珠江生化试剂公司生产）;小鼠抗大鼠突触素单克隆抗体（由克隆号SVP-38武汉博士德生产）;即用型SABC免疫组化试剂盒，（SA1022，由武汉博士德公司生产）。
1.2方法
1.2.1实验动物分组及处理 成年Sprague―Dawley雄性大鼠20只，体重200～300g，年龄六个月左右，随机分为2组，每组10只。正常对照组大鼠尾静脉注射pH4.6，0.1mmol/L枸橼酸钠缓冲液，剂量为3ml/kg，作为空白对照。糖尿病组大鼠禁食10h后，用pH4.6，0.1mmol/L枸橼酸钠缓冲液溶解STZ，配成1%溶液，3ml/kg尾静脉注射，48h后尾静脉取血Lifescan血糖仪L9416测定血糖以及尿糖试纸测尿糖，将血糖≥16.7mmol/L，尿糖（++）以上的大鼠定为糖尿病模型。所有动物均自由进食进水，以后每周测尿糖，每2周测血糖。
1.2.2免疫组织化学SABC染色成模后4周，两组实验动物均以1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，打开胸腔，经左心室向升主动脉内插管灌注0.9%氯化钠注射液及4%冷多聚甲醛固定液。取出视网膜组织置于相同固定液内后固定4h，转入30%蔗糖溶液中置于4°C冰箱过夜至组织沉底。将各组大鼠视网膜组织经矢状切面和冠状切面制做连续冰冻切片，片厚20μm，贴附于涂有铬矾明胶的载玻片上，进行SYN免疫组织化学SABC染色。具体过程如下:将冰冻切片以缓冲液PBS洗3次，1%牛血清白蛋白孵育30min，甩去血清，不洗，滴加第一抗体液（小鼠抗大鼠SYN单克隆抗体，1:150）。玻片在湿盒内4℃孵育过夜。以PBS洗3次，每次5min，加入第二抗体液（生物素化羊抗鼠IgG，来自SABC试剂盒），室温2h，以PBS洗3次，每次5min。加入第三抗体液（SABC，来自SABC试剂盒）室温2h，以PBS洗3次，每次5min。以DAB显色，显色3～7min，镜下控制。阴性对照切片不加第一抗体孵育。
1.2.3图象分析及统计学处理 各个大鼠各取1张相同部位DAB染色切片，采用UTHSCSA Image Tools3.0（由美国德克萨斯大学医学院开发）图象分析处理系统进行分析，统计切片单位面积内（μm 2 ）阳性细胞的光密度值。
1.3统计学方法 数据采用SPSS12.0进行统计学处理。两组数据进行t检验。设P<0.01为差异具有统计学意义。
2结果
2.1血糖与尿糖 糖尿病大鼠成模前，两组动物的 体重、血糖和尿糖检测结果分别为:（165.32±8.31）g，（4.76±0.52）mmol/L，（-）和（163.24±7.92）g，（4.93±0.58）mmol/L，（-），两组间无差异统计学意义（t （体重） =0.70，t （血糖） =0.31，均P>0.05）。成模后4周，糖尿病组与正常组大鼠体重、血糖和尿糖分别为:（189.13±18.41）g，（23.72±3.25）mmol/L，（++至+++）和（260.52±32.15）g，（4.95±0.52）mmol/L，（-），两组差异有统计学意义（t （体重） =8.45，t （血糖） =26.71，均P<0.01）。
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