摘 要 目的：观察维生素C（ASA）在晶体蛋白发生光氧化时的作用及其机制。方法：牛晶体蛋白溶液在加入或不加入ASA时，于5天内共接受200mJ／cm2紫外线B（UVB）照射，接着在37℃继续孵育至第3周，然后测定晶体蛋白的非色氨酸荧光、游离巯基和进行蛋白电泳分析。结果：ASA在溶液中易被氧化，蛋白溶液中加入ASA促使晶体蛋白的非色氨酸荧光产生明显增强，导致非二硫键聚合形成，对晶体蛋白的游离巯基减少有保护作用。有ASA时，UVB照射更易导致晶体蛋白形成非二硫键聚合。结论：体外溶液中的ASA易与晶体蛋白发生糖化作用，同时作为抗氧化剂能保护晶体蛋白的游离巯基不被氧化。
Effects of ascorbic acid on the photo－oxidation of crystallin
Wu Kaili．．．∥Ophthalmol CHN.－1999，8（3）.－161～164（Zhongshan Ophthalmic
Center，Sun Yat－sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510060）In order to explore the effects of ascorbic acis（ASA）on the photo
－oxidation of crystallin．Bovine crystalline solution mixed with or without ASA were irradiated with 200mJ／cm2 of UVB，and then incubated at 37℃ for three weeks．Measurement of non－tryptophan fluorescence，free sulfhydryl of protein and SDS－polyacrylamide electrophoresis were performed to compare with the alteration of lens protein under different treatments．The results showed that ASA is easy to be oxidized in solution．It promotes the production of the non－tryptophan fluorescence and the aggregation of crystallins．Irradiating the mixture of lens protein and ASA with UVB can result in obvious aggregation of crystallins through mainly non－disulfide bond．ASA can protect protein sulfhydryl against photo－oxidation．The present study suggests that ASA is easy to induce the glycation of crystallins in solution，and as an antioxidant，it can prevent the oxidation of protein sulfhydryls．
Subject terms Ascorbic acid；Crystallin；Ultraviolet rays
在人晶体老化或形成白内障时，晶体蛋白发生聚合、不溶化、变色（discoloration）、裂解（fragmentation）等，Maillard样反应是发生这类变化的机制之一［1］。维生素C（ascorbic acid，ASA）在人眼和昼行动物眼部含量很高，推测其与眼部的防御机制（如抗光氧化作用）有关［2］。同时也有相当多的体外研究显示ASA参与晶体蛋白的糖化作用，经Maillard样反应形成高级糖化终产物，但实际上与晶体蛋白发生反应的是ASA的氧化产物，如脱氢抗坏血酸（DHA）等［3，4］。晶体蛋白的巯基是易被氧化的基团，紫外线B（UVB）照射时发生光化学反应晶体蛋白的游离巯基氧化形成二硫键［5］，参与构成晶体蛋白的高分子聚合物。
为探讨ASA在眼晶体内的作用，本文中拟观察体外牛晶体蛋白溶液在接受UVB照射时，ASA对晶体蛋白发生光氧化反应的效应，并探讨其体内作用机制。
1 材料与方法
1.1 试剂
还原型ASA、0.1M磷酸缓冲液为日本和光产品。其它试剂为Sigma或和光产品。
1.2 溶液中ASA的变化
以0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）作溶剂配下列贮备液：2.5mM谷胱苷肽（GSH）、8mM二乙三胺五乙酸（DTPA）、4mMCuSO4、12mM还原型维生素C；然后按一定量混合使各溶液分别含10μMCuSO4、50μMGSH、100μMDTPA以及它们的混合液，最后加入1mM ASA（终浓度），置于37℃，避光。在加入ASA后立即取50μl溶液稀释至1ml，测定各溶液在265nm的光吸收值［6］（岛津220可见紫外分光光度计）。以后每隔20分钟重复取样测定一次，共5次。
1.3 UVB照射晶体蛋白溶液
从当地屠宰场获得新鲜牛眼，取出晶体于－20℃保存。次日即用于分离可溶性晶体蛋白，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）作晶体匀浆，离心（10 000g，1小时），取上清液作进一步处理。
将上述上清液用相同的磷酸缓冲液，稀释成约6.5mg／ml的晶体蛋白溶液，分成4组，其中2组加入4.4mM ASA（终浓度），之后将各组溶液置于石英杯中，封口。对加和未加ASA的蛋白溶液各一组进行UVB照射，不接受照射者则将其遮盖。UVB照射与我们以前的方法相同［5］。每天照射一次，每次40mJ／cm2，共照射5天（总量200mJ／cm2），之后继续孵育至第3周结束。不照射时的晶体蛋白溶液置于37℃二氧化碳培养箱，于照射前和开始照射后一周分别取部分蛋白溶液样品置于－20℃保存。
1.4 蛋白质分析
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质游离巯基及蛋白质浓度测定的方法均与我们既往报道的相同［5］。晶体蛋白的非色氨酸荧光分析根据Swarmy的方法［7］，将蛋白溶液稀释到0.1mg／ml，然后以360nm为激发波长，检测其在400～520nm的荧光发射谱。
2 结果
溶液中的还原型ASA易被氧化，图1示随观察时间延长，还原型ASA逐渐减少，在Cu＋＋存在时，其降低速度很快，而在溶液中加入GSH或DTPA抗氧化剂时，其降低减慢。
图１磷酸缓冲液中还原型维生素Ｃ量的变化
晶体蛋白的非色氨酸荧光光谱（λem＝360nm）在不同的处理中变化不相同。37℃孵育和UVB照射能促使该荧光产生（图2，b，c），加入ASA使其增加更甚（图2，d，e），UVB照射和ASA的联合作用（图2，f）与ASA的单独作用相近。提示ASA对晶体蛋白的糖化作用是很明显的。
图２晶体蛋白的非色氨酸荧光光谱
图3示ASA对溶液中晶体蛋白光氧化聚合的影响。37℃孵育晶体蛋白3周后，见有高分子聚合带出现，这些带能够被二硫代苏糖醇（DTT）解开（图3－1），说明聚合是由二硫键构成；UVB照射所引起的聚合主要是二硫键和少部分非二硫键组成（图3－2）；当加入ASA培育3周后，高分子晶体蛋白聚合带更明显，部分聚合能够被DTT还原（图3－3）；在四种处理方法中，以加入ASA后又接受UVB照射的晶体蛋白所形成的聚合最明显，尤其是非二硫键聚合更甚，某些非二硫键的高分子蛋
白聚合物甚至不能进入分离胶（图3－4）。
图３晶体蛋白溶液３７℃孵育３周后的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳图
通过测定晶体蛋白的游离巯基可见（图4），无论在照射后的第一周或第三周的样本，UVB照射均引起蛋白的游离巯基减少，而加入的还原型ASA则使溶液中的游离巯基的变化与对照样品相同，其减少是孵育过程所致，说明ASA有保护蛋白巯基的作用。
图４晶体蛋白游离巯基的变化
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