【摘要】 了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium, RPE)细胞的凋亡情况。方法：将培养的人RPE细胞置于含10mL/L O2、50mL/L CO2和940mL/L N2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1，3，6，12，24h，利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平。结果：常氧状态下RPE细胞生长良好，几乎没有凋亡（TUNEL法测凋亡指数为1.2）。缺氧条件下，RPE细胞发生了不同程度的凋亡，缺氧后3h凋亡水平达峰值（凋亡指数为34.43）。结论：缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡，提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生。
【关键词】 视网膜色素上皮细胞 缺氧 凋亡
0引言
缺血缺氧是许多眼底疾病致病因素之一。大量研究证实[1,2]，缺氧诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生，并参与了眼底新生血管性疾病的发生和发展。但是对于缺氧条件下RPE细胞凋亡的特征却了解甚少。越来越多的证据表明，RPE细胞凋亡在多种眼底疾病（如年龄相关性黄斑变性[3]、遗传性外层视网膜营养不良[4]和增生性玻璃体视网膜病变[5]等）发生中扮演了重要的角色。因此，了解缺氧条件下RPE细胞凋亡情况对于未来通过调控凋亡防治缺血缺氧性眼底疾病具有重要意义。
1材料和方法
1.1材料
第二代体外培养的人RPE 细胞由第四军医大学西京医院眼科、全军眼科研究所赵炜博士惠赠。DMEM 培养液和新生牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司），CO2孵箱（Sanyo公司），三气孵箱（Heraeus公司），净化工作台（锡山市深化空调设备厂），倒置生物显微镜（Olympus公司），倒置荧光相差显微镜（Leica公司），流式细胞仪（Beckmancoulter公司）。
1.2方法
1.2.1 RPE细胞传代培养
细胞原代培养方法参见文献[6]，将第2代RPE细胞复苏后接种于含100mL/L灭活新生牛血清的DMEM培养液的细胞培养瓶中，置37℃、50mL/L CO2的孵箱培养，次日更换培养液继续培养，之后每3d更换1次培养液，待细胞生长近铺满时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代。选择第3～7代细胞用于实验。
1.2.2 RPE细胞缺氧处理
接种于培养瓶或盖玻片的RPE细胞培养至约80％铺满时，将细胞置于37℃三气孵箱内（条件：10mL/L O2，50mL/L CO2，940mL/L N2）继续培养1，3，6，12，24h，以建立细胞缺氧模型。同时以培养在普通培养箱（37℃，50mL/L CO2）的同一细胞系的同一代细胞作为正常对照。在各观察时间点结束时，收集细胞分别用于流式细胞仪、透射电镜、光镜和扫描电镜等观察。表1 缺氧对体外培养RPE细胞凋亡的影响(略) 表2 缺氧时间与RPE细胞凋亡的关系(略) 注：Q1：坏死或机械性损伤的细胞；Q2：晚期凋亡继发性坏死细胞；Q3：正常活细胞；Q4：早期凋亡细胞。Q2＋Q4： 凋亡细胞总数（表中数据为各类细胞占细胞总数的百分数值）。bP<0.01 vs 常氧组（缺氧0h）；dP<0.01vs 缺氧3h组,Q2+Q4组间比较P<0.01
1.2.3光镜观察及TUNEL染色
在倒置显微镜下观察常氧及缺氧条件下培养在盖玻片上的RPE细胞。并使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对上述细胞进行染色，荧光显微镜下随机选取10个视野计数细胞核呈绿色的TUNEL阳性细胞，计算阳性细胞百分率作为凋亡指数。
1.2.4透射电镜样本制备
将收集的RPE细胞以0.01mol/L PBS洗涤2次，25g/L戊二醛4℃固定2h以上。经锇酸固定后行梯度脱水、浸透、包埋，制备超薄切片，铀铅电子双染色后行透射电镜观察。
1.2.5扫描电镜样本的制备
将细胞爬片标本梯度脱水后行乙腈置换，真空干燥，用真空蒸镀金属膜法行导电处理后，扫描电镜观察细胞表面结构。
1.2.6流式细胞仪测定凋亡情况
将生长在培养瓶的细胞经2.5g/L的胰酶消化制成单细胞悬液，每样本细胞数约5×106个，800r/min离心5min，弃去培养液。用PBS漂洗2次，加入100μL Binding Buffer和FITC标记的AnnexinV（20g/L）10μL，室温避光30min，再加入PI（50g/L）5μL，避光反应5min后，加入400μL Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测，同时以不加AnnexinVFITC及PI的标本作阴性对照。
统计学处理：实验重复3次。采用单因素方差分析（F检验），应用SPSS统计软件（10.0版）处理，为双侧检验，检验水准α=0.05
2结果
2.1光镜观察
对照组培养的RPE细胞呈多边形、扁圆形或梭形，细胞贴壁生长，少见漂浮细胞。缺氧处理的RPE细胞折光性差，部分细胞皱缩、变圆，可见胞膜鼓泡现象（图1）。
2.2扫描电镜及透射电镜观察
扫描电镜显示，常氧状态下培养的RPE细胞生长状态良好，胞膜完整，表面微绒毛丰富（图2A）。经缺氧处理后，大部分RPE细胞与周围细胞连接消失，细胞突起和表面微绒毛减少，甚至消失，并见凋亡小体与细胞脱离（图2B）。透射电镜显示，缺氧3h部分细胞表面微绒毛消失，细胞核变圆，核内染色质边集或凝结成团块状，胞质皱缩，并在细胞内或胞外可见凋亡小体（图3A，B）。
2.3 TUNEL法测定凋亡指数
荧光显微镜下可见凋亡细胞核呈绿色，核膜完整，并可见染色质分布不均、核浓缩聚边形成新月形核及环形核等典型的凋亡表现（图4）。RPE细胞在缺氧条件下出现明显凋亡，且凋亡指数在3h时达最大（表1）。
2.4流式细胞仪测定凋亡情况
流式细胞仪检测显示，RPE细胞在缺氧3小时凋亡达高峰，24h后凋亡细胞比例下降（表2），与TUNEL结果基本一致。
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