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3讨论
临床上视神经损伤对患者的视力有严重影响，但至今对于损伤机制的深入研究却由于无法直接获取损伤后的视神经而不能在临床实施，因此实验动物作为替代物在一定程度上起到了弥补的作用。多年来为了研究哺乳动物受损神经和视网膜对损伤反映的特征，并观察一些药物对视神经损伤和神经节细胞退变、凋亡的治疗效果，常用大鼠作为研究对象[9-11]。视神经损伤模型从损伤的程度或轴突的丧失量而言，可以分为完全损伤和不完全损伤2类，临床上常见不完全视神经损伤而很少有完全的横断性视神经损伤。我们采用挤压伤模型（crush），即使用器械在视交叉前的视神经部位夹持一段时间，造成RGC轴突的不完全损伤，而视神经外膜仍保持完整性，是国外被公认为较精确的和最常用的视神经不完全损伤模型[12]，而且有学者把该模型作为中枢神经损伤和青光眼视神经损伤模型进行神经保护研究[13,14]。此模型的优点是：可以定量化：（1）使用同一把无创动脉阻血镊，依靠器械本身反向压力致伤保证了致伤压力相同，且通过测量可以明确该压力数值；（2）夹持损伤保持了视神经外膜的完整性，同时伤后眼底血液循环未见明显障碍，比较以往的模型更接近于临床视神经损伤过程；（3）可重复性好：将非实验因素控制到了最小程度，如动物的性别、体重、饲养环境
相同、损伤部位均为眼球后2mm，所有动物模型手术均由同一实验者完成，故动物实验的重复性好。视神经组织光镜观察结果显示视神经损伤后神经纤维均发生了病理改变，证明该模型致伤确切、可靠。
视神经是由RGC的轴突和其鞘膜组成，RGC通过视神经纤维的轴浆运输与上一级神经元之间进行物质运输和交换。这种轴浆流动是双向的，它包括由胞体流向轴突末梢的顺行流动和由轴突末梢流向胞体的逆行流动，在RGC将视觉信号传递到大脑的同时，逆行轴浆运输将生长因子及其它营养因子传回节细胞，这些因子可维持RGC的正常功能，提高它的生存能力[15]。研究结果表明视神经损伤后轴浆运输受到阻碍，随后触发了RGC复杂的细胞凋亡及抗凋亡机制。Quigley等[16]1995年在实验性轴突横断术早期阶段就发现有典型凋亡的RGC，Chierzi等[17]在Bcl2转基因小鼠实验中的研究结果也证明了视神经损伤后RGC的凋亡，他们通过进一步研究发现Bcl2转基因小鼠视神经损伤后Bcl2的过量表达能够显著抑制RGC的凋亡。多数文献认为，视神经损伤后RGC的溃变与损伤的部位及时间有明确的相关性，损伤部位越靠近细胞体、损伤时间持续越长，神经元损伤越重。本实验中大鼠球后视神经损伤1～24h光镜下视网膜的病理改变不明显，其主要原因可能是视神经眼球端残存的内源性神经营养因子对受损神经元发挥了短暂的支持作用。流式细胞仪检测到的早期凋亡从损伤后1h开始增高到24h达到高峰，提示视网膜细胞凋亡过程由损伤直接触发，呈现逐渐增强趋势。但AVPI双染法检测结果为细胞早期凋亡率，说明此时统计的凋亡细胞正处于细胞凋亡进程的早期，仍然存在于视网膜组织中，因此在1～12h的视网膜组织切片中RGC并未出现明显丢失。本实验中1d～15d RGC数目明显减少，15～30d RGC数量的变化差别不大，这与Gellrich等[18]的观察结果相一致。据此认为视神经损伤后，在各个时间段RGC的丧失率不同，存在着一个快速细胞丧失期。
针对于RGC凋亡的细胞通讯及细胞信号转导变化国内外学者已经进行了大量研究，发现Caspases、BCL2家族、p53基因等均在凋亡不同阶段发挥着不同作用。但对于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的重要成员P38蛋白激酶在视神经损伤后是否参与RGC凋亡目前少有报道。我们成功建立视神经不完全损伤模型后，采用免疫组化方法检测到视神经损伤后P38MAPK活性的表达。存在于正常视网膜神经节细胞中的P38MAPK不具有活性[19]，本实验中正常对照组与假手术组磷酸化（活化）P38MAPK表达阴性也证明了这一点。视神经损伤组中P38MAPK活性的表达首先出现于损伤后6h，表达逐渐增强至24h达峰值后又减弱，与此同时流式细胞仪检测到的视网膜早期细胞凋亡率也在24h时间点达到最高峰。这充分说明了P38MAPK的活化与视网膜神经细胞凋亡有密切联系，P38MAPK的活化主要位于神经节细胞层，因此可能是RGC凋亡过程中的一个早期表现。此外，RGC内P38蛋白激酶在不同部位的染色强度也随时间推移发生了变化。高倍显微镜摄片显示染色阳性信号出现于损伤后6h的胞膜和胞质，12h后染色强度增强，弥散性分布于胞质和胞核，到损伤后24h染色强度最为明显，集中于细胞核中，细胞质染色强度相对降低，这提示视神经损伤后P38MAPK迅速激活并由胞质移位到胞核。与此对应的早期细胞凋亡率逐渐增加，同时达到高峰。这种变化进一步证明P38MAPK参与RGC的凋亡过程，其机制可能是无活性的P38MAPK弥散分布在细胞中，受到应激信号如视神经轴突损伤后激活，转位到细胞核内以磷酸化形式激活其下游底物，从而引起一系列应激反应导致细胞凋亡。这一激活过程已经在心肌细胞、脑细胞中阐明，具有普遍性意义[20]。
理解哺乳动物视觉系统的实验性损伤，是为了考察人类各种视神经病变的神经生理反应。对视神经损伤后RGC凋亡过程中细胞通路及细胞信号转导变化的研究能够进一步阐明神经细胞凋亡的发生机制，同时为临床上有效阻断原发的损伤活动或增强视网膜神经节细胞的生存机制提供充足的理论依据。本实验通过建立大鼠视神经损伤模型，观察了视神经损伤后视网膜组织学结构改变、早期细胞凋亡率及凋亡相关蛋白激酶P38MAPK活性的表达，实验结果显示视神经损伤后存在RGC快速凋亡期，P38MAPK活性的表达具有特殊的时程变化。提示P38 MAPK活性的表达可能与RGC早期细胞凋亡具有密切关系，P38MAPK信号转导通路在RGC凋亡中起到重要作用。抑制P38MAPK的活化可能为研制视神经保护药物，临床治疗视神经损伤提供新的途径。
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