作者：吴瑜瑜    作者单位：福建医科大学第二临床医学院 眼科，福建 泉州 362000

    【摘要】  目的 探讨核因子-κB（nuclear factor-κＢ，ＮＦ-κＢ）是否参与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）调节人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）表达基质金属蛋白酶－3（matrix metalloproteinases－3，MMP-3）和基质金属蛋白酶－9（matrix metalloproteinases－9，MMP-9）的过程。方法 采用 RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）检测体外培养的人眼小梁细胞经0 ng/ml（对照组）、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml TNF-α处理24 h后，细胞表达MMP-3、MMP-9的量；运用ＮＦ-κＢ的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制ＮＦ-κＢ的活化，观察TNF-α对体外培养的HTCs MMP-3，MMP-9表达影响的改变。结果 运用RT-PCR法和酶谱分析法研究均发现经浓度为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的TNF-α处理的细胞在mRNA和上清液中活性蛋白水平均能增加MMP-3、MMP-9的表达，各组mRNA/β-actin吸光度比值和条带酶解量与对照组相比差异均有显著性（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3、MMP-9的表达量分别较未加入PDTC组表达量明显减少，差异有显著性（P<0.05）。结论 TNF-α可上调MMP-3及MMP-9的表达，PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，因此推测ＮＦ-κＢ可能参与MMP-3和 MMP-9转录的启动。

    【关键词】  细胞培养 小梁细胞 肿瘤坏死因子-α 基质金属蛋白酶 核因子-κB

    原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）是一种慢性进行性前部视神经病变，伴有典型的视神经凹陷、萎缩及视野缺损，房角是开放的。然而迄今为止，其病因及发病机制尚不清楚。许多研究发现POAG患者小梁网中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常堆积，房水流出阻力增加。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类金属依赖性的蛋白水解酶家族，是降解细胞外基质主要的酶。激光小梁成形术（laser trabeculoplasty，LTP）是治疗POAG的一种有效的方法，术后发现房水的流出率增加，同时房水中的肿瘤坏死因子-α（tumor necrotil factor-α，TNF-α）分泌增加，推测两者之间存在相关性，即激光小梁成形术可能通过诱导增加细胞因子TNF-α分泌来增加小梁的MMPs家族，尤其是MMP-3及MMP-9的表达。核因子-κＢ（nuclera facotr-κＢ，ＮＦ-κＢ）是一种可快速对外界刺激做出反应的核转录因子，被激活后结合至DNA相应的位点，调节下游靶基因的转录表达，它可被多种物质激活，如TNF-α。故本实验采用RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）观察不同浓度TNF-α对体外培养的人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）MMP-3和MMP-9表达的影响，并运用ＮＦ-κＢ的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制ＮＦ-κＢ的活化，观察抑制后TNF-α对小梁细胞MMP-3和MMP-9表达影响的改变，并探讨这种改变的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  眼球  来源于意外死亡的健康成年人眼球组织，均经家属自愿签署知情同意书后取材，供体年龄在25~45岁之间，共7只，死亡后24 h内取材。

    1.1.2  主要试剂  DMEM/F12培养液，胰蛋白酶（Gibco公司），Hank’s液（Hyclone公司），胎牛血清（华美公司），重组人TNF-α、标准MMP-3、MMP-9（R&D公司），鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体（anti-FN），鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体（anti-NSE）（北京中山生物技术有限公司），鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体（anti-LN）， SP试剂盒，AEC Kit（福州迈新生物技术开发公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理水（上海化学试剂有限公司），逆转录试剂盒（Fermentas公司），PCR试剂盒（上海博亚生物技术有限公司），PCR Mark （CASARRAY），明胶、酪蛋白、PDTC（Sigma公司），40%丙烯酰胺、Tris、SDS、过硫酸铵、TritonX-100、甘氨酸、叠氮钠、CaCl2·2H2O、ZnCl2、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、甲醇、冰乙酸、甘油（上海生物技术开发公司）、TEMED（Amreso公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养及鉴定  人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）的体外培养采取组织块法[1-3]。应用解剖显微镜于无菌条件下，沿角膜緣后3~5 mm处环形剪开，去掉后节，前节倒置于无菌台上。在解剖显微镜下把自制的细铜丝插入Schlemm氏管，仔细分离小梁网，剪成2 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，放入25 ml培养瓶底中，贴壁30 min后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于含5% CO2、100%湿度、37℃ 恒温培养箱中培养。当细胞融合后用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代培养。于光镜、倒置显微镜、透射电镜下观察，并进行纤维连结蛋白（fibronectin，FN）、层黏连蛋白（laminin，LN）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）免疫组化染色。另将消化后的细胞离心后弃上清，加入2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液固定，送电镜室常规透射电镜标本制备，观察细胞超微结构并摄片。

    1.2.2  实验分组  取第3代HTCs以5×104/ml的浓度接种于6孔板中，待细胞融合后，无血清培养   48 h后，随机分为6组：1~4组施加TNF-α终浓度分别为0（对照组）、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的培养液（不含血清），第5，6孔以100 ?滋mol/L的（PDTC）预处理30 min后，分别于TNF-α终浓度为10 ng/ml、25 ng/ml的培养液（不含血清）中培养， 均培养24 min后进行下一步的RT-PCR。另收获细胞培养上清液，记录细胞数，于离心半径4.5 cm，2000 r/min离心10 min，提取上清液，于-70℃冰箱保存，进行酶谱实验。

    1.2.3  RNA提取  取上述培养的HTCs，按试剂盒说明书采取Trizol一步法提取总RNA，经含溴化乙啶的甲醛琼脂糖凝胶电泳，紫外光透射下可见清晰完整的18S和28S条带，经紫外线分光光度计检测纯度（OD260/OD280）在1.8以上，各组取总RNA 2 ?滋g，加OligodT18primer（0.5 ?滋g/?滋l） 1 ?滋l加DEPC-treated water至12 ?滋l，混匀轻离心后70℃水浴孵育5 min，立即置于冰上。加入5×reation Buffer 4 ?滋l，10 mM dNTP 2 ?滋l，RibolockTM Ribonuclease inhibitor （20 U/?滋l） 1?滋l，混匀轻离后37℃水浴孵育5 min。加入RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase （200 U/?滋l） 1?滋l，混匀轻离后42℃水浴孵育60 min。70℃水浴10 min终止反应，合成的cDNA置于-20℃保存备用。

    1.2.4  逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）  各取   2 ?滋l cDNA进行PCR扩增。MMP-3引物合成参照Li等[2]的报道，MMP-9和β-actin引物应用primer5.0软件自行设计，上述引物均由博亚生物制品有限公司合成。MMP-3引物的序列上游为5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′，下游为5′- TGAGTCAATCCCTGGAAAGTC-3′，片断长度432 bp；MMP-9引物的序列上游为5′-GGGACGGCAATGCTGAT-3′，下游为5′-CGCCACGAGGAACAAACT-3′，片断长度362 bp；选取β-actin作为内对照，β-actin引物的序列上游为5′-CTATTGGCAACGAGCGGTTC-3′，下游为5′-CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT-3′。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度不同引物各有不同（MMP-3退火温度为55℃，MMP-9为60℃，β-actin为58℃）1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。分别取5 ?滋l扩增产物（MMP-3，MMP-9）与β-actin扩增产物混合上样，加Maker 3?滋l，在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳， 经凝胶电泳图像分析仪拍照，并分析电泳条带的相对灰度值，计算出目的基因的mRNA水平的相对表达量。所有实验均重复3次，所得数据均采用均数±标准差表示。

    1.2.5  酶谱分析（zymography）法[3-4]  用分别含有酪蛋白和明胶的SDS-PAGE检测MMP-3和MMP-9的活性。分离胶浓度为8%（含0.2%酪蛋白或明胶），浓缩胶为5%，根据各处理组细胞数调节培养上清液的上样量。同时加入标准MMP-3和MMP-9作为标准对照。SDS-PAGE电泳结束后，凝胶连续振荡于2.5%Triton X-100溶液中以除去SDS。将凝胶置于反应液（50 mmol/L Tris，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 ?滋mol/L ZnCl2，pH值为7.5）中37℃孵育24 h，0.1%考马斯亮蓝染色液染色2 h，脱色液脱色至蓝色背景下白色条带清晰。此凝胶经凝胶成像分析系统分析读取条带面积和灰度。条带酶解量=条带面积×（条带灰度-背景灰度），以反映酶的含量。

    1.2.6  统计学方法  以上实验重复3次。所有数据均以均数±标准差形式表示，采用SPSS for Windows11.0软件进行Levene方差齐性检验，单因素六水平设计定量资料的方差分析，LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。单因素六水平设计定量资料的方差分析，LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。

    2  结果

    2.1  ＮＦ-κＢ在TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9表达影响中的作用

    2.1.1  RT-PCR结果  Trizol一步法提取的总RNA经紫外线分光光度计检测纯度（OD260/OD280）在1.8以上。体外培养的HTCs总RNA经逆转录、扩增后得到目的基因MMP-3，MMP-9的片断分别约为432 bp（碱基），362 bp，扩增出的内参β-actin片断约为776 bp，与预期结果一致。?譹?訛体外培养的HTCs中MMP-3和MMP-9 mRNA有一定量的表达（见图1、图2）。?譺?訛实验数据见表1，表2。经Levene方差齐性检验，P>0.05，因此各组方差齐性，故采用单因素六水平方差分析，F值分别79.935和66.514，P<0.05，总的来说：四种不同浓度TNF-α调节HTMc表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值有差别（见表1，表2）。经LSD两两组间多重比较：对照组与实验组三种不同浓度TNF-α相比调节人眼小梁网细胞（human trabecular meshwork cells，HTMc）表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值差异均有显著性（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值均较未加入PDTC处理组明显减少（P<0.05）。

    2.1.2  酶谱分析（zymography）技术对MMP-3和MMP-9的定量分析  用含有酪蛋白或明胶的SDS-PAGE对MMP-3或MMP-9的活性检测结果表明，各组细胞培养液均可使酪蛋白底物和明胶水解（见图3、图4）。实验数据见表1和表2，经Levene方差齐性检验，P>0.05，因此各组方差齐性，故采用单因素六水平方差分析，F值分别169.203和40.193，P<0.05，总的来说：四种不同浓度TNF-α 调节 HTMc 表达MMP-3和MMP-9条带酶解量均有差别。经LSD两两组间多重比较：对照组与实验组TNF-α终浓度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml相比调节 HTMc表达MMP-3和MMP-9条带酶解量（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3和MMP-9条带酶解量均较未加入PDTC处理组明显减少（P<0.05）。

    3  讨论

    3.1  MMPs与POAG的关系  POAG是主要的致盲眼病之一，其发病机制尚未完全阐明，眼压升高及其视神经损害是其主要特征。许多学者发现POAG患者小梁网中细胞外基质异常堆积，如：弹力样纤维鞘源性物质、弹力蛋白、纤维连接蛋白增多[5]。

    MMPs属于Zn2＋依赖性内肽酶家族，在自然生理和病理过程中的细胞外基质降解过程中发挥重要作用。MMPs家族成员目前有25个，而且仍有新成员不断加入。根据底物的特异性的不同分为5大类[6]：①胶原酶。②明胶酶。③基质溶素。④膜型。⑤其他MMPs。其中MMP-3是一种基质溶素，可降解包括Ⅲ，Ⅳ，Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅸ，Ⅹ 型胶原、层黏连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白等在内的许多ECM成分，在胚胎发育和组织塑型中起着不可取代的作用[7]；MMP-9又名明胶酶B，具有降解变性胶原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原的活性，其抑制剂为TIMP-1和TIMP-2。

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