【摘要】目的：研究海藻萃取物糖康乐在高糖条件下对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞超氧化物歧化酶（SOD）表达的影响。
方法：应用体外培养的兔RPE细胞，分成空白对照组、高糖组（用25mmol/L）葡萄糖处理、糖康乐组和牛磺酸组4组（n=6），应用高浓度葡萄糖后，糖康乐组加以不同浓度的糖康乐，同时应用牛磺酸作为阳性对照，测定不同浓度的糖康乐对RPE细胞SOD表达的影响。
结果：在高糖条件下，高糖组RPE细胞SOD含量明显降低(2 024±91→747±353kat/L)(t=8.570，P<0.001)，糖康乐在浓度为0.002mg/L(t=3.207，P<0.01)、0.02mg/L (t=4.235，P<0.01)和0.2mg/L (t=3.748，P<0.01)的时候可以显著地抑制SOD表达的降低，与高糖组相比较有显著的差异，与阳性对照组的牛磺酸组相比，未见明显差异。
结论：糖康乐可保护高糖导致的RPE细胞SOD表达的降低。
【关键词】 糖康乐 超氧化物歧化酶 视网膜色素上皮细胞 高糖
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是常见糖尿病并发症，被认为是严重的致盲原因［1］ 。DR的一个重要环节就是眼底新生血管的形成，近年来，关于眼底新生血管的大量研究证实,视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cell, RPE）可以表达色素上皮衍生因子（pigment epithalium derived factor,PEDF）［2］，从而抑制眼底新生血管的增殖。RPE细胞在视网膜的病理、生理过程中扮演着重要的角色，然而RPE在代谢过程中若过度氧化，则会造成RPE细胞的损伤。当发生氧化损伤时，作为一种防御，RPE细胞会产生一种叫做超氧化物歧化酶（superoxide dismutases,SOD）的物质［3］，SOD是抗氧化损伤的重要酶类，它的活性可以反映出组织或细胞的抗氧化能力［4,5］。当损伤严重时，抗氧化损伤的活动相对增强，SOD的消耗也相应地增多。RPE细胞正是通过产生SOD来消除自由基，从而对抗氧化损伤。以往，我们在抗氧化损伤方面所选用的药物，在长期的应用后，都会或多或少地产生不同的副作用，因此，我们有必要寻求一种毒性低且可以长期应用的药物。在本实验中，我们应用了一种从海藻萃取物中获得的化合物—糖康乐，探讨其在抗氧化损伤以及预防和治疗DR 方面的作用。
1材料和方法
1.1材料 将有色兔麻醉处死，摘取眼球，DHanks液冲洗数遍，4 °C冰箱内庆大盐水浸泡30min，显微镜下除去眼前节及视网膜，应用酶消化法，在眼杯中加入250g/L胰蛋白酶，37 °C水浴消化30min，用100mL/L胎牛血清(FBS)的DMEM/F12（Gibco公司）培养液终止消化，将眼杯内细胞反复吹打下制成细胞悬液。细胞培养应用含有100mL/L胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液，每100mL的培养液中含有88mL的DMEM/F12培养液，10mL的FBS (Biotech公司)，2mL的青霉素(10U/L)+链霉素(10g/L) (Gibco公司)。应用ABC法进行细胞鉴定。细胞培养在37℃，50mL/L CO2孵箱内，每2～3d换1次培养液，每7～8d传代1次，传代时应用2.5g/L的胰蛋白酶。糖康乐是由日本芦北发育性残疾人治疗机构、芦北药园生产并为本试验无偿提供的。SOD试剂盒(Biosytech SOD Colorimetric Assay kit)购买自Oxis International, Inc.公司。 SOD试剂盒遵循如下的方程式：2O2ˉ·+ 2H → H2O2 ＋O2 。应用MTP800分光光度计（Coronaelectric，东京，日本），于525nm处测定吸光度。
1.2方法 应用第3代兔RPE细胞，将细胞以 2.0×105 cells/well 的密度接种于24孔平板中培养72h后，将24孔随机分成4组：空白对照组(negative组)、高糖组(HG组)、糖康乐组（Tangkangle组）和牛磺酸组（positive组）。糖康乐组的浓度分别为0.0002，0.002，0.02，0.2，2，20，200mg/L，牛磺酸的浓度为1mmol/L。继续培养72h。严格按照SOD 试剂盒说明，测量上清培养液中SOD的含量。应用MTP800分光光度计，测定在525nm处的吸光度值，每组实验测量均大于3次。
统计学处理：使用SPSS 10.0 for Windows软件，统计分析方法应用Student t检验，分析数据用以均数±标准差形式（±s）表示。P＜0.05差异具有统计学意义。
2结果
2.1高糖对RPE细胞SOD含量的影响 葡萄糖25mmol/L使RPE细胞SOD含量明显降低与空白组比较，差异具有统计学意义（2 024±91→747±353kat/L，P＜0.001）。
2.2糖康乐对RPE细胞SOD含量的影响 葡萄糖25mmol/L作用后，作为阳性对照组的牛磺酸可以抑制SOD 的含量的降低，与高糖组相比较有显著的差异(P<0.01)。糖康乐在浓度为0.002，0.02，0.2mg/L时，可以明显抑制SOD 含量的降低，与高糖组相比较有显著的差异（P<0.01），与阳性对照组的牛磺酸相比，未见明显差异（表1）。
表1 高糖条件下RPE细胞SOD的含量相比较（略）
3讨论
细胞培养是将从机体取出的细胞在体外进行培养，使之继续生存和生长的一种方法，是目前医学生物学研究领域普遍采用的基本技术，也是发展最快和应用最广的一种体外培养方法。尽管体内的实验更接近真实状态，但体内的影响因素较多，受多种因素干扰.我们采用细胞培养技术，建立兔RPE细胞的体外模型。体外培养时25～30mmol/L的葡萄糖水平，可近似地等同于糖尿病时体内的葡萄糖水平［6］，鉴于此，本实验研究选用葡萄糖浓度为25mmol/L，来研究高糖条件下，糖康乐对RPE细胞SOD表达的影响。
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