【摘要】目的：建立体外RPE细胞损伤模型，观察损伤诱导的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞移行以及MMP2和MMP9的表达。
方法：在近铺满期视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞培养板上，采用角膜移植用的环钻和棉签法做圆形细胞刮伤区,SABC免疫组织化学方法检测RPE细胞受创后48h MMP2和MMP9的表达；并应用此损伤模型，计数进入缺损区的细胞数，观察地塞米松(Dex)对RPE细胞移行和对MMP2及MMP9表达的影响。
结果：RPE细胞受创后损伤边缘的RPE细胞逐渐向缺损区移行；免疫组化结果显示,损伤后48h损伤边缘移行的RPE细胞呈MMP2的阳性表达，MMP9呈强阳性表达。Dex处理组中损伤诱导的RPE细胞移行明显减少，MMP2和MMP9的表达也明显减弱。
结论：MMPs在RPE细胞移行修复中有重要意义，Dex可以通过抑制 MMP2和MMP9的表达而减少RPE细胞移行。
【关键词】 基质金属蛋白酶 视网膜色素上皮细胞 损伤模型 细胞移行 免疫组化
0引言
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE) 细胞的移行是增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)发生的重要环节［1,2］，如何减少细胞移行是研究的一个重点。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)参与降解细胞外基质(ECM)的多种蛋白成分，对细胞移行及ECM的重建起着重要作用。我们建立一种体外RPE细胞损伤模型，模拟PVR病程中RPE细胞的移行反应，观察损伤诱导的RPE细胞移行以及MMP2和MMP9 的表达，研究二者在RPE细胞损伤和PVR 发生中的作用。
1材料和方法
1.1材料 鼠抗人MMP2和MMP9抗体购自美国Nemarker公司，羊抗鼠IgG、链霉亲和素生物素复合物（SABC）免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，丝裂霉素C（2mg）和地塞米松(Dex)为美国Sigma公司产品。取本实验室传代的人RPE细胞第4～7代用于实验［３］。用含100mL/L小牛血清的Dulbecco改良Eagle 培养基和Hams F12(DMEMF12)的混合完全培养基（青霉素100kU/L, 链霉素100kU/L），将RPE细胞以5×107/L的细胞密度接种于12孔培养板上，置于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养48h。细胞近85%铺满后换用无血清DMEMF12培养基，使细胞静止24h。刮伤模型的建立采用角膜移植用的环钻（直径6.5mm），轻轻放在培养板上，从孔内伸入消毒棉签将环钻覆盖区内RPE细胞轻轻刮去，一个孔做2个刮伤区（图1A），DHanks液轻柔冲洗脱落细胞3次。更换新的无血清培养液，继续置于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养。于损伤后48h弃培养液, 0.1mmol/L PBS浸洗3次，冰40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，空气中干燥，20℃冰冻保存备用。一孔未做刮伤的细胞做对照组。
1.2方法 将培养板上已固定的RPE细胞，用PBS洗5min，5mL/L H2O2/甲醇室温处理30min,灭活内源性过氧化物酶；正常山羊血清封闭30min，吸取多余液体，不洗；滴加一抗，抗体滴度1∶100，湿盒内4℃过夜，复温后PBS洗涤3次,每次2min；滴加1∶100稀释生物素化羊抗鼠IgG，湿盒内37℃1h，PBS洗涤3次,每次2min；滴加SABC, 37℃30min，PBS洗涤4次，每次5min。显微镜下控制DAB显色时间，苏木素复染，脱水、透明、封片。具体步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用PBS代替鼠抗人MMP2和MMP9抗体。免疫组化结果以背景清晰、细胞质内淡黄色染色记为弱阳性，黄色为阳性，棕黄色染色为强阳性。每个标本观察5个视野。另将RPE细胞以5×107/L的细胞密度接种于12孔培养板上，置于37℃，50mL/L CO2孵箱中培养48h。细胞近铺满后在DMEMF12中加入丝裂霉素C（10mg/L）培养2h，以抑制细胞的增生能力。如前做细胞损伤模型，试验分2组，一组为损伤诱导的基础移行组，另一组加入1mg/L Dex。继续培养48h后，弃去培养液，40g/L多聚甲醛固定30min，HE染色，在100倍显微镜下每孔选择5个视野，计数越过刮痕线进入刮痕区的细胞数，每组设3个孔，实验重复3次。
统计学处理：两组之间移行能力的差别采用SPSS 10.0 统计软件独立样本的t检验分析处理。P<0.05 为差异有显著性意义。
2结果
2.1移行实验 损伤可以诱导RPE细胞移行，RPE细胞受创后损伤边缘的RPE细胞逐渐向缺损区移行（图1B）。基础移行组48h时平均移行细胞数为43.7±13.2，Dex 组平均移行细胞数为30.9±8.4，两组之间差异具有统计学意义（P=0.0026，P<0.05）。也就是 1mg/L Dex对损伤诱导的RPE细胞移行有抑制作用（图1C）。
图1 损伤模型诱导RPE细胞移行 （略）
A:融合RPE细胞刮伤即刻。可见中央无细胞区域，箭头所示弧线为刮痕线；B:刮伤48h后可见部分细胞移行进入刮伤区； C:Dex(1mg/L)作用组刮伤48h可见移入缺损区的RPE细胞数明显减少
2.2 MMPs表达 损伤后48h损伤边缘向缺损区移行的RPE细胞呈MMP2的阳性表达(图2A)，MMP9呈强阳性表达(图2B)；Dex处理组中移行的RPE细胞MMP2和MMP9均呈弱阳性表达（图2C）；未做刮伤的对照组MMP2染色为弱阳性，MMP9的表达为阴性。
图2 移行RPE细胞 MMPs表达（SABC×100）（略）
A:刮伤48h MMP2表达阳性； B:刮伤48h MMP9表达强阳性； C: Dex(1mg/L)作用组刮伤48h MMP9表达弱阳性
3讨论
视网膜裂孔形成和视网膜脱离 (retinal detachment,RD) 发生后，RPE细胞从原位的静止状态逐渐移行到视网膜表面和玻璃体纤维或胞外基质上，在获得重新的附着后具有异常增生和合成胞外基质的能力。这个过程被视为RPE细胞损伤后的自我修复过程［1,2］。并且RPE细胞的移行被认为是PVR等疾病发生的重要起始阶段［2］。在RPE 细胞自原位移行的过程中，要穿越玻璃体纤维并侵入玻璃体组织，对细胞外基质（ECM）的降解是其移行的关键步骤之一。因此针对RPE细胞移行的主要环节采取干预措施，对预防和治疗PVR等玻璃体和视网膜疾病都有重要的意义。MMPs是一组含锌的中性内肽酶,主要作用是降解胶原等ECM。迄今为止已发现19个亚型。其中明胶酶主要有两种形式，一种是分子量为72kDa的 MMP2 (明胶酶 A)，另一种分子量为92kDa 的MMP9(明胶酶 B)；两种酶性质相似，均以非活性酶原形式分泌，能降解明胶、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和弹性蛋白，在组织损伤修复中起着不同的作用。基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs）是MMPs重要的抑制因子，二者共同参与了细胞迁移和ECM的重建，二者的调节平衡在玻璃体变性液化、PVR、增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)等玻璃体和视网膜疾病中起重要作用［4,5］。
视网膜前膜和视网膜下增生膜有 MMP1,MMP2,MMP3,MMP9和TIMP1表达，而在正常的尸眼视网膜只有MMP1的表达，推测MMP2,MMP9 和TIMP1 在PVR 形成过程中起着重要作用［6］。尽管MMPs 参与PVR 形成的机制还不确切,但研究发现,从孔源性RD患者行玻璃体切除术中取出的玻璃体液分析MMP2 和MMP9的含量和活性，随访患者术后是否发生PVR，结果显示 MMPs 的水平与术前PVR 的存在并无明显意义的相关，但与术后PVR 的发生却有显著的相关性，因此认为检测玻璃体MMP2和MMP9 的水平可预示孔源性RD术后PVR的发生率［7］ 。虽然MMP2和MMP9有很多共性,但它们的作用及调节因素不完全一样。研究发现MMP2普遍存在于正常、异常玻璃体中，它的活性与玻璃体的液化和变性有关，被认为是一种组织“监视器”，保证一些明胶或受损的胶原及时清除；其表达水平与单纯性RD、孔源性RD继发PVR、以及PDR无显著相关性，而MMP9的表达水平却依次增强［8］。研究认为MMP9可能与ECM 的急性调节反应有关。正常人玻璃体无MMP9的表达，而伴有PVR复发高危因素的玻璃体如玻璃体积血、葡萄膜炎和无晶状体眼等，玻璃体内 MMP9的水平明显升高，可能是由于MMP9能降解Ⅳ，Ⅴ胶原和基底膜成分，有利于RPE细胞和炎症细胞浸润和转移，促使玻璃体和视网膜前膜形成，导致PVR的发生［9］。
早在2001年Singh等［10］和Yoshida等［11］就已经利用体外培养的单层RPE细胞损伤愈合模型，模拟PVR病程中RPE细胞的增生和移行反应，研究RPE细胞损伤后的基因表达或炎性因子表达情况。既往的损伤模型有梳状细胞刮伤、剃刀横行细胞刮伤等各种方法。此类损伤模型已被作为体外研究RPE细胞和PVR的较经典的一个模型。我们采用角膜移植用的环钻和棉签法做圆形细胞刮伤区,这样重复的每个模型中细胞被刮出的范围是一致的，更容易对移行细胞做定量分析。并且，我们将RPE细胞用丝裂霉素C处理并采用无血清培养液，消除了细胞增生及血清中其它成分的影响。观察到近铺满期RPE细胞受创后，损伤边缘的RPE细胞逐渐向缺损区移行，移行的RPE细胞 MMP2和MMP9呈阳性表达；提示细胞受创使RPE细胞 MMP2和 MMP9的表达上调，尤其是MMP9的水平，移行RPE细胞高表达MMP2 和MMP9，可能与其降解基底膜胶原，使RPE细胞移行至异常部位黏附，然后发生一系列的病变特点有关。
大多数MMPs从细胞中分泌出来，在细胞外被激活后才能降解胶原和其它基质蛋白，MMPs 基因表达和酶的合成受许多因素的调控。孔源性RD发生后，RPE细胞暴露在变性、液化的玻璃体微环境中，RPE细胞和外周的ECM相互接触可激活MMPs 的表达。同时，RPE细胞在移行和增生的过程中可以分泌多种生长因子和炎前因子，这些因子又促进RPE细胞 MMPs的分泌和合成，包括肿瘤坏死因子( TNFα)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素1(IL1)、转化生长因子(TGFβ)和血小板源性生长因子(PDGF)等［12］。我们的试验显示，Dex可以明显抑制RPE细胞的移行，同时RPE细胞对MMP2和MMP9的表达也明显减弱。考虑与糖皮质激素可通过受体结合后进入细胞，与启动子内被称作糖皮质激素反应因子的特定序列结合, 降低MMPs的表达，使RPE细胞降解胶原和ECM的能力减弱，从而进一步减少了细胞移行。我们认为，RPE细胞移行是RD发生后损伤修复的一个重要过程，MMPs在RPE细胞移行修复中有重要意义；Dex可以通过抑制 MMP2和MMP9的表达而减少RPE细胞移行。因此通过调控 MMPs 的分泌和活性，可能寻找到一种防治PVR 的新途径。
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