作者：王桂云 车松天 李旭 隋桂琴 左玲 作者单位：(吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041)
【摘要】 目的 探讨微量全氟加萘（PFD）对视网膜毒性作用的时间关联性。方法 将100 μl的PFD及BSS液体分别直接注射到家兔视网膜表面，注射液体后每日用检眼镜观察家兔视网膜情况，在注射后的4、7、14、21 d，分别对实验组及对照组产物做光学显微镜及透射电镜的视网膜组织切片的观察。结果 所有实验样本检眼镜检查及光镜病理组织学检查在各个时间均正常，未发现视网膜有任何病理改变。透射电镜检查，4 d时，没有对视网膜造成实质性的损害；从7 d开始，各个实验组的视网膜都开始有了病理变化，出现了光感受器外节、外丛状层的损害，光感受器变性，内核细胞囊泡形成、神经节细胞的损害，内层视网膜坏死，视网膜内吞噬细胞反应，视网膜色素上皮细胞吞噬膜盘，顶部微绒毛的脱落。结论 微量的PFD存在于眼内，视网膜可出现超微结构的病理改变，但无显微结构的变化，在宏观上也无任何改变。视网膜毒性作用随着残留时间的延续而加大，微量残留PFD应该在4 d之内取出。
【关键词】 全氟加萘；视网膜/病理学
基金项目：吉林省科技厅科技发展计划资助项目（20050111）
Time relevance of trace PFD with toxicity in rabbit retina
WANG GuiYun, CHE SongTian, LI Xu, et al.
Department of Ophthalmology, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China
【Abstract】 Objective Through pathological and histological examination on retina, to research the dosage relevance of trace perfluorodecalin (PFD) with toxicity in rabbit retina, and provide experimental reference basis for clinical practice.Methods The surface of rabbits′ retina were directly injected with 100 μl liquids of PFD and BSS. The conditions of rabbits′ retina were observed under ophthalmoscope every day after injection. The sections of retina tissue were observed under transmission electron microscope in each experimental and control groups at the 4th,7th,14th and 21st day after injection. Results All samples were normal under ophthalmoscope′s examination while no pathology change of retina was found. At the 4th day, none substantial damage had been made in any dosage groups through transmission electron microscope′s examination. From the 7th day, similar pathological changes were found in all experimental groups: damage on outer segments of light receptor and outer plexiform layer, properties changes of light receptor，forming of vesicles of inner nuclear cells, damage of ganglion cell, dying of inside retina, actions of gulping cells in retina, swallow of film plates by pigment epithelial cell of retina, and dropping of top fine hair. Conclusions The trace PFD exists in eyes. There are ultrastructure pathological changes, but there is no change of the microstructure and the macroscopical. The more time is long, the more reaction of retinal toxicity is serious. The trace PFD should be removed earlier within 4 days.
【Key words】 Perfluorodecalin (PFD); Retina/pathology
全氟加萘(perfluorodecalin，PFD)是重水的一种，由饱和碳碳和碳氟原子分子链组成的含有10个碳原子的重的惰性液体。因其独有的特性而被临床用作玻璃体手术中的“液体操作工具”〔1〕，在眼科的手术中得到了广泛的应用。PFD对视网膜组织的一定毒性作用，已有广泛报道。但是关于微量PFD残留时间与视网膜损伤程度之间关系的研究少见报道。本文通过对家兔视网膜的病理组织学检查，旨在探讨微量PFD对视网膜的毒性作用与时间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂及仪器 健康实验家兔，体重2.5 kg，雌雄各半(本校实验动物中心)；PFD（德国），BSS液（爱尔康公司）；OMS610显微镜（日本），100 μl微量进样器（上海），YZ6E检眼镜（苏州），JEM1200EX透射电镜（日本）。
1.2 分组及手术方法 将8只实验家兔的16只眼随机设为实验组12只眼、对照组4只眼，实验组给予PFD 100 μl。对照组给予BSS液体。实验前3 d，用0.25%氯霉素眼液点术眼。实验时美多丽P术眼散瞳，用5%乌拉坦溶液耳缘静脉注射，按每公斤体重5 ml溶液实施全身麻醉，贝诺喜眼液点术眼角膜实施眼表麻。麻醉后，眼周碘酊消毒，铺无菌洞巾，置于显微镜下，结膜囊冲洗，用穿刺刀在距角巩膜缘2 mm的11点及1点处垂直睫状体平坦部刺向玻璃体中心，角膜上置一斜镜，将导光纤维伸入眼内。在其照明下，实验组用改良后无菌的100 μl微量进样器分别将50、100 μl已消毒的PFD注射到三个实验组眼的下方视网膜表面；对照组同法注入BSS液体。用5个零的黄线缝合巩膜穿刺口，庆大霉素1万单位、地塞米松2 mg结膜下注射，金霉素眼膏、1%阿托品眼膏涂眼。
1.3 术后处理和观察 注射液体后每日用检眼镜观察家兔视网膜情况，在注射PFD后的4、7、14、21 d，分别对每个实验组的3只眼及对照组的1只眼的视网膜做光学显微镜及透射电镜组织学切片观察。
1.4 透射电镜样本制作方法 (1）前期4%戊二醛固定。(2）清洗：以0.1 mmol/L磷酸缓冲液清洗样品2次，每次1.5 h。(3）后固定：将样品置于1%锇酸（OsO4）溶液中，室温固定1.5 h。(4）清洗：蒸馏水冲洗样品20 min。(5）脱水：采用乙醇逐级增加浓度的方法脱水，浓度依次为50%、70%、90%，每级脱水10 min；然后用95%乙醇与95%丙酮比例为1∶1的混合液进行脱水，接下来用95%丙酮脱水，每级脱水10 min；最后用100%丙酮脱水2次，每次30 min。(6）氧化丙烯浸泡样品20 min。(7）包埋剂（环氧树脂812，DDSA，MNA，DMP30）与氧化丙烯比例为1∶1的混合液浸泡样品1 h。(8）包埋剂（环氧树脂812，DDSA，MNA，DMP30）浸泡样品3 h。(9）将样品放入恒温箱包埋，温度依次是35℃、45℃、55℃，时间为每次12 h。(10）LKBⅢ型超薄切片机切片定位→超薄切片（50～70 nm）。(11）醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色。(12）透射电镜观察、摄片。
1.5 统计学分析 对所有实验样本视网膜透射电镜下的病理变化进行等级评定，分为5个等级，进行KruskalWallis检验。
2 结果
2.1 检眼镜检查 实验组在4、7、14、21 d时的玻璃体透明，视网膜呈橘红色反光，在其表面可见边界清晰、聚集成滴的PFD，始终未有变化。对照组的玻璃体、视网膜未见任何变化。
2.2 光镜检查结果 实验组在4、7、14、21 d时接触过PFD的视网膜组织及未接触过PFD的视网膜组织均无变化，可见视网膜结构完整，视网膜色素上皮层呈多角形规则排列，其余各层细胞排列规则、完整，未见炎症、变性、坏死等改变。对照组始终未有任何变化。
2.3 透射电镜检查结果 4 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，1眼视网膜出现视细胞核周围间隙略增大，核略不规则，基质略致密，细胞形态没有明显改变，排列规则，其他各层结构完整，细胞膜透明，细胞完整。7 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，可见视杆细胞外节的膜盘排列紊乱，黏连，视细胞层视细胞大小不等，略不规则，胞质内有小空泡改变，节细胞可见许多空泡（图1）。14 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，视杆细胞外节的膜盘细小、排列紊乱、结构消失，内节胞质内线粒体肿胀，色素上皮细胞顶部可见少量微绒毛，细胞内色素颗粒增加，可见空泡状结构，可见大颗粒吞噬膜盘片段（图2）。21 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，视杆细胞外节的膜盘细小、排列紊乱、结构消失，内节胞质内线粒体肿胀，视细胞顶端线粒体肿胀，可见髓样小体；色素上皮细胞顶部可见少量微绒毛，细胞内色素颗粒增加，可见空泡状结构，可见大颗粒吞噬膜盘片段；内核层的双极细胞可见核呈不规则形，核内染色质趋边凝集，胞质内可见大量空泡结构，线粒体肿胀；节细胞层细胞核固缩，胞质致密（图3）。4、7、14、21 d时，对照组及实验组未接触过PFD的视网膜未发现有任何病理改变。根据所有组织样本透射电镜下超微结构的损害程度不同，进行KruskalWallis检验，结果具有显著性差异(P＝0.014 7，＜0.05)，见表1。表明视网膜毒性反应可以随着微量PFD残留时间的延续而不断加重，视网膜的毒性反应与微量PFD的残留时间呈正相关性。
图1 注射PFD后7 d家兔视网膜超微结构改变(透射电镜×7 500)（略）
图2 注射PFD后14 d家兔视网膜超微结构改变(透射电镜)（略）
图3 注射PFD后21 d家兔视网膜组织的超微结构改变(透射电镜)（略）
表1 KruskalWallis检验分析（略）
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