作者：杨瑞华，陈景元，邓中荣，刘学东，刘秀红
关键词: 视网膜神经节细胞;细胞培养
摘 要:目的 建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的体外培养方法，并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用，为RGCs的体外实验研究奠定基础. 方法 进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养，观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况，研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用. 结果 视网膜细胞混合培养时，神经节细胞生长良好，纯化后的神经节细胞间连接减弱，细胞存活时间缩短. 结论 视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长.
Pig retinal ganglion cells in culture
YANG Rui-Hua，CHEN Jing-Yuan，DENG Zhong-Rong，LIU Xue-Dong，LIU Xiu-Hong
Department of Occupation and Environment Health，Faculty of Preventive Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:retinal ganglion cells;cell culture
Abstract:AIM To establish a culture method for retinal ganglion cells（RGCs）and to investigate reciprocity among inhomogeneity cells of retina in order to lay a foundation for the experimental research in vitro.METHODS Retinal cells were cultured in commixture and retinal ganglion cells in pu-rification，to observe the state of ganglion cells and its axon.RESULTS Retinal ganglion cells that cultured in commix-ture grew very well.The connects of purified ganglion cells were weakened，and the time of cells alive shortened.CON┐CLUSION Culturing retinal cells in commixture benefits the paste and growth of ganglion cells.
0 引言
自Raff等［1］ 采用完全消化法于体外成功地培养了生后2～3d大鼠视网膜神经节细胞（retinal gan-glion cells，RGCs）以来，许多学者曾先后对其进行过研究，视网膜细胞培养常采用组织块体外培养法，用无血清培养液在高浓度氧环境下孵育［2］ ，但视网膜组织块培养难以观察神经元与胶质细胞间的相互作用，而且无血清培养液价格十分昂贵.因此，寻求一种简便易行的视网膜神经细胞培养方法，对深入探讨视网膜神经细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及防护具有十分重要的意义.
1 材料和方法
1.1 材料
眼球来源于西安市肉联厂;木瓜蛋白酶（中科院上海生化所东风生化技术公司）;牛血清白蛋白（中国医学科学院血液学研究所）;DL-半胱氨酸，Poly-lysin（Sigma），DMEM培养基（Gibco公司）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;YJ-875医用净化工作台（苏州净化仪器厂）;TE-HER式数字式CO2 培养器（日本平泽制造厂）;其它试剂均为分析纯.
1.2 方法
1.2.1 视网膜细胞混合培养
选用屠宰场宰杀后的猪立即摘取眼球，剪除周围结缔组织，清水充分洗涤，2000u L-1 的庆大霉素浸泡20min，移入超净工作台，沿眼球赤道部环形切开眼球，去除晶体及玻璃体，轻轻剥离视网膜感觉层，剪碎后加入2.5g L-1 胰酶消化30min，加入1mL DMEM-10mL L-1 小牛血清终止消化，以吸管吹打使之成单细胞悬液，离心洗涤，计数后以1×106 mL-1 细胞密度接种于培养瓶中，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱培养.
1.2.2 视网膜神经节细胞纯化培养
眼球处理方法同上所述，将剪碎的视网膜组织置于含牛血清白蛋白（0.2g L-1 ）、DL-半胱氨酸（0.2g L-1 ）、木瓜蛋白酶（433.42mmol L-1 s-1 ）的Hanks液中，于37℃消化40min［3］ .离心洗涤后接种培养.细胞贴壁后，以细胞擦去除残余胶质细胞，继续培养观察.
1.3 RGCs鉴定
1.3.1 倒置显微镜观察
以倒置显微镜观察细胞形态，并于细胞培养24，48h时，在倒置显微镜下用目镜测微尺测量神经节突起生长的长度.测量时在高倍镜下选取突起可完全与其它细胞突起区别的神经节细胞，每次测量选取10个.
1.3.2 电子显微镜观察
贴壁细胞经木瓜蛋白酶消化后，以平衡盐溶液洗涤2次，30mL L-1 戊二醛固定细胞24h，10g L-1 锇酸后固定30min，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，用醋酸铅-枸橼酸铅双染后，JEN-2000EX型透射电镜观察.
1.3.3 免疫组织化学
将贴壁生长的细胞用40g L-1 多聚甲醛固定，抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）常规免疫组化染色.
2 结果
2.1 光镜观察
2.1.1 视网膜细胞混合培养
接种后24h时悬浮细胞较多，少数细胞贴壁，细胞呈圆形，部分贴壁细胞可见突起（Fig1）.培养2d时，突起伸长，可见少量梭形的双极细胞.培养6d以后，可见视网膜细胞突起间相互接触，各神经细胞之间形成网络状结构，建立起非常广泛的联系（Fig2）.其中细胞可分为两类:①细胞体积较小，折光性强，伸出细长突起，抗NSE免疫组化染色阳性（Fig3），确认为神经节细胞;②细胞边界不明显，折光性差，排列紧密，分裂增殖旺盛，从形态学上判断为星形胶质细胞.继续培养2wk后，细胞突起缩短和消失，个别细胞有空泡出现，呈现逐渐趋向死亡的过渡状态.
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