于细胞贴壁后用细胞擦去除胶质细胞后继续培养，神经节细胞突起有回缩现象，且细胞突起的伸展方向背向擦除部位.部分细胞于培养4d可相互连接形成“桥”样结构，大多数细胞于生长7d后逐渐缩小，漂浮.
    
　　2.2 视网膜神经节细胞的超微结构  透射电镜下可见神经节细胞较小，核大，核膜清晰，染色质分散均匀，可见核仁，胞质量少，富含线粒体（Fig4）.
   
　　2.3 神经节细胞轴突生长情况  培养2d时，两种培养方法轴突长度分别为（43.4±14.2）μm和（49.7±14.5）μm，无明显差别，但继续培养至第6天，混合培养组细胞轴突长度为（101.6±18.1）μm，较4d前明显延长（P<0.01），纯化培养组细胞轴突长度为（45.2±24.6）μm，较4d前未见明显增长.10d以后，混合培养的细胞生长良好，纯化培养的细胞轴突缩短或消失，可见细胞内出现空泡或细胞漂浮.
     
　　3 讨论
    
　　3.1 视网膜神经节细胞培养方法建立 

　　视神经、视网膜属于中枢神经系统的一部分.视网膜神经节细胞的损伤常引起不可逆性视力丧失，探讨视网膜神经节细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及如何促进细胞轴突的再生，是临床和基础研究共同关注的热点.RGCs培养可为体外研究神经节细胞的损伤及其恢复提供最直接的实验手段.我们采用视网膜细胞消化分散培养，此法操作简便，有利于观察视网膜不同类型的细胞形态及相互作用.我们观察到培养的视网膜细胞有两类:①有细长突起伸出的小圆细胞;②增殖旺盛的扁平细胞.小圆细胞及其突起抗NSE染色阳性，确认为RGC.Melvin曾描述了类似形态的细胞［4］ ，确认其为视网膜神经节细胞，他同时还指出分裂迅速的扁平细胞为Muller细胞或星形胶质细胞.

　　电镜观察显示，神经节细胞核较大，胞质少，内含大量的线粒体，说明神经节细胞的氧化磷酸化过程和能量代谢非常活跃，与中枢神经系统的结构特点非常相似，了解这一特点为研究视觉神经通路的功能提供了结构基础，对环境因素致视网膜损伤的机制研究也有十分重要的意义.
   
　　培养细胞贴壁后，去除胶质细胞，剩余较纯化的视网膜神经节细胞继续培养，细胞在6d之内生长良好，以后逐渐趋向死亡，说明用视网膜消化分散培养可获得体外RGCs培养的成功，且能够较好地观察不同细胞类型间的相互作用.
    
　　3.2 视网膜细胞混合培养的意义 

　　体外细胞培养一般多努力使细胞纯化，以观察单一细胞群体的作用，RGCs的原代培养国内报道较少，且体外存活时间短［5，6］ ，应用神经生长因子等可促进神经节细胞的存活及轴突伸展，但因其价格昂贵，不易推广使用.Vig等［7］ 的研究表明，培养的单纯细胞与体内相比，可能处于一种激活状态，对其进行刺激后产生的效果与体内相差很大.我们的实验显示，纯化培养的视网膜神经节细胞在培养6d以后轴突逐渐缩短或消失，细胞生长趋于退化和死亡，而进行视网膜细胞混合培养，可使神经节细胞在体外培养2wk后仍维持较好的活性.研究报道，视网膜神经节细胞在受到微波辐射损伤时，最初的反应为细胞轴突缩短和消失，细胞变圆［8］ ，可见细胞轴突的变化是细胞的一种保护性反应.视网膜神经节细胞的纯化培养与混合培养相比，细胞生长时间短，细胞活性差，可能与纯化培养时，神 经细胞和其他胶质细胞之间的信号联络被切断，使细胞处于应激状态，产生自身保护反应有关.
   
　　因此，我们进行的视网膜细胞的混合培养，不仅有利于视网膜神经节细胞的生长，有利于建立和加强神经元细胞间相互联系，而且可以同时观察视网膜不同类型细胞的相互作用，用该培养模型进行视网膜损伤研究，更接近于整体条件下的反应情况.

　　参考文献:
    
　　［1］Raff MC，Fields KL，Hakomori SI，Mirsky R，Pruss RM，Win-ter J.Cell-type-specific markers for distinguishing and studying neurons and the majorclasses of glial cells in culture ［J］.Brain Res，1979;174:283-308.

　　［2］Baehr M，Bunge RP.Functional status influences the ability of Schwann cells to support adult rat retina ganglion cells survival and axonal regrowth ［J］.Exp Neurol，1989;106（1）:27-40.

　　［3］Takahashi N，Cummins D，Caprioli J.Rat retinal cells in cul-ture ［J］.Exp Eye Res，1991;53（5）:565-572.

　　［4］Oka MS，Frederick JM，Landers RA，Bridges CD.Adult human retinal cells in culture:Identification of cell types and expression of differentiated properties ［J］.Exp Cell Res，1985;159（1）:127-140.

　　［5］Zhong YS，Jiang YQ，Xiong XL.Culture of retinal ganglion cells of rat ［J］.Zhonghua Yanke Zazhi（J Opthol Chin），1999;35（2）:137-139.

　　［6］Liu XD，Gong SM，Guo SY，Yang RH，Deng ZR，Chen JY.Selenium protective effects on retinal nerve cell damage induced by centimeter microwave ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（10）:897-899.

　　［7］Vige X，Tang B，Wise BC.Cortical neurons inhibit basal and in-terleukin-1-stimulated astroglial cell secretion of nerve growth factor ［J］.Brain Res，1992;591（2）:345-350.

　　［8］Yang RH，Chen JY，Deng ZR，Liu XD，Liu XH，Zhao RG.Ef-fect of zinc on lipid peroxidation induced dy microwave ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（8）:940-942.
    
　　基金项目: 学校科研基金（97011）  

　　作者简介:杨瑞华（1970-），女（汉族），山西省阳泉市人.硕士，讲师.Tel（029）3374866

　　[email protected] 

　　（第四军医大学预防医学系劳动与环境卫生学教研室，陕西西安710033）

　　收稿日期:2001-01-02

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