作者：陈书扬 1 ，吴瑜瑜 1 ，朱益华 2 ，林 玲 3 ，李贵州 2

　　摘要: 目的  探讨黏附分子CD 44s 在体外培养人眼小梁细胞（HTC）的表达及其与小梁细胞结构和功能的关系。  方法  对体外培养的HTC应用流式细胞术和RT-PCR法检测CD 44s 的表达。  结果  HTC高表达CD 44s 黏附分子，阳性细胞数达92%以上，而且均表达CD 44s mRNA。  结论  体外培养的HTC表达CD 44s 黏附分子。CD 44s 与其配体透明质酸（HA）的协同性调节HTC的内环境并在维持其结构和功能方面起重要作用。
    
　　关键词:  小梁网;细胞培养;抗原，CD 44 ;青光眼
         
　　房水流出通道的阻力增加，从而导致眼内压升高是原发性开角型青光眼（POAG）的一个重要病理特征，而房水流出通道的病变部位目前公认位于小梁网。因此，对人眼小梁细胞（HTC）及其生物学特性的研究是青光眼领域研究的热点之一。随着分子生物学和免疫学的进展，在CD 44 生物学功能和化学本质认识的基础上，人们逐渐认识到CD 44 分子在维持HTC结构和功能方面可能起一定作用，并与POAG发病之间存在着某种联系。为此，本研究在体外培养HTC成功的基础上，应用RT-PCR和流式细胞术检测HTC是否表达CD 44s ，并探讨CD 44s 分子的表达与HTC生理功能之间的关系，从而进一步探讨与POAG发病之间的关系。
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 主要材料 DMEM/F12培养液（美国GBI-COL公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司），鼠抗人纤维黏连蛋白单克隆抗体及鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD 44s 单克隆抗体（奥地利Bender公司），Trizol试剂盒（美国Promega公司），超净工作台（美国Thermo Forma公司），CO 2 培养箱（美国CELLSTAR公司），流式细胞仪（美国Beckman公司），PCR扩增仪（2400型，美国PE公司）
   
　　1.2 方法
    
　　1.2.1 HTC的体外培养及鉴定 HTC的体外培养同文献［1］。取2个捐赠的眼球，供体均为男性，年龄分别为28岁、37岁。无菌条件下沿角巩膜缘后3～5mm处环形剪开，去掉后节，前节倒置于无菌台上，解剖显微镜下把自制细铜丝插入Schlemm管，仔细分离小梁网，剪成2mm×1mm×1mm的小块，放入25mL培养瓶底，贴壁30min后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，置CO 2 培养箱内，在体积分数为0.05、37℃、接近饱和湿度条件下的CO 2 中培养，细胞汇合后0.25%胰蛋白酶消化传代，分别于光镜、倒置显微镜及透射电镜下观察，并行纤维连接蛋白、层黏连蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色鉴定。
   
　　1.2.2 流式细胞术 取培养于25mL培养瓶传3～5代接近融合的细胞，吸弃旧培养液，经0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS调整细胞数为1×10 6 mL -1 ，各取单细胞悬液100μL，取1瓶作为同型对照（阴性对照），加入FITC标记的羊抗鼠IgG（IgG-FITC）10μL;其余加入异硫氰酸荧光素10μL标记的鼠抗人CD 44s 单克隆抗体（CD 44s -FITC），混匀，室温，避光，孵育30min，PBS洗2次，调整细胞浓度为1×10 6 mL -1 上机，每次计数5000个，根据阳性细胞数和荧光强度确定CD 44s 蛋白表达量。

　　1.2.3 RT-PCR
   
　　1.2.3.1 总RNA的提取 取培养于25mL培养瓶传3～5代接近融合的细胞，吸弃旧培养液，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，并取少量样品作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析，其余-80℃保存备用。
   
　　1.2.3.2 cDNA合成 根据逆转录试剂盒说明书进行。反应体系如下:取总RNA2μg，Oligo（dT15）0.5μg，加去离子水至10μL，置PCR仪，70℃、5min变性，立即取出置于冰上，再依次加入下列试剂，25mmol/L MgCl 2 4μL，10×Buffer2μL，10mmol/L dNTP2μL，Oligo（dT15）0.5μg，rRNasin0.5μL，M-MLV20U，最后加去离子水至20μL充分混匀后置PCR仪上，42℃孵育60min，然后72℃灭活5min结束。合成的cDNA作为PCR反应的模板，-20℃保存备用。
   
　　1.2.3.3 PCR （1）引物的合成:采用Jumper报道的人CD 44s 和人甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶（G3PDH）引物 ［2］ 。人CD 44s 的引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成。
    
　　上游（5'-3'）:5'-CAGTCATAGTACAACGCTTCA-3'，下游（5'-3'）:5'-ATTCAGATCCATGAGTGGTAT-3'，扩增产物片段长204bp。
   
　　G3PDH的上游（5'-3'）:5'-ACCACAGTCCATGC-CATCAC-3'　下游（5'-3'）:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增产物片段长439bp。
    
　　（2）PCR反应体系:进行PCR反应时按下列步骤加入试剂:cDNA0.5μL;dNTP mixture，10mmol/L1.8μL;MgCl 2 ，25mmol/L7.5μL;Reverse Transcription10×Buffer9.8μL;Upstream primer50pmol;Downstream primer50pmol;Taq DNA Polymerase2.5u;最后加入Nuclease-free Water至终体积为100μL。（3）PCR反应条件:94℃4min→94℃30s→55℃30s→72℃40s，30个循环，最后72℃延伸5min。
   
　　1.2.3.4 PCR产物电泳 制备含EB的2%琼脂糖凝胶，取5μL PCR产物上样电泳，以PUCMix8（北京天为时代科技有限公司DNA MarkerⅠ）作Marker，电压100V，电泳40min，经凝胶电泳图像分析仪（Gel Doc1000型，美国Bio-Rad公司）拍照。
    
　　2 结 果
    
　　2.1 HTC的体外培养及鉴定 HTC于培养后10d左右，开始由组织块边缘移出，倒置显微镜下呈多种形态，2～3周融合成单层细胞层，透射电镜可见细胞表面微绒毛多见，细胞间以缝隙连接为主要方式，胞质内次级溶酶体多见，纤维连接蛋白、层黏连蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色阳性，符合HTC的特点 ［3］ 。
   
　　2.2 流式细胞术 与同型对照比较，CD 44s 在体外培养的HTC中高表达，阳性细胞数平均为92.6%，平均荧光强度37.7（道）（图1）。
   
　　2.3 RT-PCR 总RNA提取后取2μL经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA无明显降解。紫外线分光光度计测定总RNA的光密度D 260 和D 280 ，两者比值 1.8～2.0。细胞总RNA经逆转录、扩增得到内对照G3PDH的片段约439bp，细胞总RNA逆转录后扩增出的目的基因片段约为204bp，与预计结果相同（图2）。说明在体外培养的HTC中表达CD 44s  mRNA。
      
　　图1  － 图2  略

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