作者：徐国兴，谢茂松，傅冷西，郭健，杨娟，丁静文    作者单位：福建医科大学附属第一医院、福建省眼科研究所，福州 350005

　　【摘要】  目的 研究γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素10（IL-10）对体外培养人类视网膜色素上皮（HRPE）细胞免疫活性的影响。 方法 采用流式细胞术检测IFN-γ、IL-10对HRPE表面人白细胞抗原（HLA）-ABC、HLA-DR和胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。 结果 HRPE基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR。IFN-γ可增强HRPE HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1的表达（P<0.001）;IL-10对HRPE基础性HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1的表达无影响（P>0.05）;IL-10可明显下调IFN-γ诱导HRPE HLA-DR的表达（P<0.001）。 结论 IFN-γ可增强HRPE HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1的表达，参与HRPE移植后的免疫排斥和炎症反应;IL-10可降低HRPE HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1的表达，抑制抗原呈递，诱导HRPE移植时免疫耐受或免疫赦免。

　　【关键词】  视网膜;色素上皮，眼;γ干扰素Ⅱ型;白细胞介素10

　　尽管视网膜下腔被认为是相对的免疫赦免区，但动物和人体实验长期随访发现视网膜色素上皮（RPE）移植仍存在慢性排斥反应。γ干扰素（IFN-γ）是一炎前因子，参与人类视网膜色素上皮（HRPE）移植后免疫排斥和炎症;白细胞介素10（IL-10）是一重要的抗炎因子，可降低HRPE抗原性并抑制抗原呈递，在诱导HRPE移植时免疫耐受、免疫赦免中起重要作用。笔者研究IFN-γ、IL-10对HRPE人白细胞抗原（HLA）-ABC、HLA-DR和胞间黏附分子1（ICAM-1）表达的影响，为探讨HRPE移植免疫排斥及免疫赦免机制和诱导HRPE移植免疫赦免奠定实验基础。
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 主要仪器 CO 2 培养箱（美国Forma）、BDHC-B00ⅡA/B生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、倒置相差显微镜（日本Olympus）、Coulter Epics XL流式细胞仪（Beckman）、HE-8211K恒温振荡仪（太仓科教器材厂）。
   
　　1.2 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清与0.25%胰蛋白酶为Gibco公司产品。EDTA粉、PBS粉为Sigma公司产品。IFN-γ、IL-10为美国R&D公司产品。鼠抗人角蛋白质-18抗体为北京中杉公司产品，鼠抗人HLA-ABC单克隆荧光抗体（FITC标记）、鼠抗人HLA-DR单克隆荧光抗体（Pcy5标记）、鼠抗人ICAM-1单克隆荧光抗体（PE标记）为Coulter公司产品。
   
　　1.3 HRPE细胞的取材和原代、传代培养及鉴定 取角膜移植供体的健康成人眼球，用灭菌冰盒转移至生物安全柜内，修剪球壁结缔组织，75%酒精润洗眼球2次，用含500IU/mL青霉素的PBS液冲洗干净，由角膜缘后3.5mm处环形剪开眼球壁，去除眼前节、玻璃体。将后段眼杯置于自制的眼球托上，不含血清的DMEM/F12培养液冲洗眼杯并用滴管反复吹打，使眼球内壁表面菲薄的视网膜神经上皮层脱离，视乳头前网膜去除干净，必要时辅以显微镊剪除。加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化10min。取出、吸除其中液体，加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化30min。取出后加含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液（完全培养液），终止胰蛋白酶反应，并用滴管吹打眼球内壁，以使RPE细胞脱落分散。将含RPE细胞的液体移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清。加入少许0.25%胰蛋白酶再次消化，吹打约5min后再加入完全培养液终止消化。再次离心弃上清后，加入完全培养液将RPE细胞悬浮并以2.0×10 5 接种于25cm 2 培养瓶中，置于37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养 ［1］ 。3d后开始换液，采用半量换液法，每2d换液1次。当细胞增殖到单层融合时（约80%）按1∶3传代。细胞鉴定采用角蛋白18免疫组织化学SP法。
   
　　1.4 IFN-γ、IL-10对HRPE细胞HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的影响 HRPE免疫活性采用流式细胞仪检测HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的表达。采用第3代细胞进行实验:（1）对照组:未加细胞因子;（2）IFN-γ组（500IU/mL，72h）;（3）IL-10组（200IU/mL，96h）;（4）IL-10（200IU/mL，96h）+IFN-γ（500IU/mL，72h）组。检测时吸除瓶内旧培养液，PBS液润洗培养瓶后再加5mL0.04%EDTA的PBS液进行消化（37℃30min，至贴壁细胞间出筛状间隙为止），用细胞刮匙将细胞自瓶壁上轻轻刮下吹散并移入离心管，短时低速离心，弃上清;加10%鼠血清PBS液（封闭非特异性结合位点）1mL吹打5min后静置30min，并短时低速离心，弃上清;加PBS液3mL将细胞吹打均匀，用300目尼龙网过滤成单细胞，短时低速离心;加标记的抗体在恒温振荡仪（26℃，80r/min）上染色30min，短时低速离心，弃上清加入PBS0.4mL上机测定细胞阳性率和平均荧光强度。
   
　　1.5 统计学处理 统计数据采用SPSS11.0统计软件处理。定量资料以均数±标准差表示，采用ANOVA检验;对P<0.05者采用LSD-T检验进行组间两两比较。
    
　　2 结果
    
　　2.1 细胞鉴定结果为细胞阳性率为100%（图1）。2.2 IFN-γ、IL-10对HRPE HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的影响 HRPE细胞表面阳性率见表1，平均荧光强度见表2，流式细胞仪检测结果见图2。
    
　　表1  IFN-γ、IL-10对HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的影响（阳性率）（略）

　　与对照组比较，*:P<0.05，**:P<0.01;与IFN-γ组比较，#:P<0.05，##:P<0.01（下表同）.
    
　　表2  IFN-γ、IL-10对HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的影响（平均荧光强度）（略）

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