作者：刘柳 张晓农 作者单位：430030武汉，华中科技大学附属同济医院眼科
【摘要】 目的 探讨环氧合酶2（COX2）在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）中的表达及COX2选择性抑制剂对视网膜母细胞瘤细胞的作用机制。方法 应用链霉亲和素蛋白生物素酶标免疫组织化学方法（labell streptavidin biotin method, LSAB）, 对37例RB组织中COX2的表达进行分析。培养视网膜母细胞瘤细胞HXO RB44，检测COX2选择性抑制剂NS 398对细胞增殖的影响。结果 COX2在RB中的阳性表达率为75.7%（28/37例），与RB的分化程度和视神经浸润无关（P＞0.05）；NS 398对HXO RB44的抑制作用具有时间及剂量依存性。结论 COX2可能在视网膜母细胞瘤的发生和发展中起重要作用，COX2选择性抑制剂NS 398对视网膜母细胞瘤细胞HXO RB44有明显抑制作用。
【关键词】 视网膜母细胞瘤 环氧合酶2 NS398 免疫组织化学
视网膜母细胞瘤（RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤。由于临床视网膜母细胞瘤的发现大多处于中晚期，治疗多为手术摘除眼球及眼外粒子束放射治疗。20世纪80年代后期，世界上对RB治疗原则中，越来越多的采用化学治疗减容方法，在实验研究中，也开始利用体外培养的RB细胞株，探索、筛选各种对RB细胞产生生物学效应的化学试剂，为化学治疗RB创出新路。
近几年，国内外诸多研究表明环氧化酶 2（cyclooxygenase2,COX2）参与肿瘤的发生和进展，而且非甾体类抗炎药通过抑制COX2的表达，具有预防和治疗肿瘤的作用。我们用免疫组化方法检测视网膜母细胞瘤中COX2蛋白的表达情况，培养HXO RB44，一株来源于实体RB的恶性细胞系细胞，用NS 398作用于细胞，通过MTT比色法测定细胞增殖活性，来探讨COX2在视网膜母细胞瘤发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 37例RB组织来自同济医院1980年1月～2002年7月间存档蜡块，其中男性24例，女性13例，病人年龄在1～12岁之间，平均年龄3.8岁，其中分化型19例，未分化型18例。有视神经浸润13例，无视神经浸润24例，远处转移0例。HXORB44细胞购自湖南医科大学肿瘤研究所。
1.2 主要试剂 COX2抗体（Santa Cruz公司），NS 398（Cayman公司），RMPI1640和小牛血清（Gibcol公司），噻唑蓝（Sigma公司）。
1.3 实验方法 ① COX2蛋白的检测：COX2免疫组织化学染色，采用LSAB免疫组织化学方法，作微波抗原修复。实验对照采用结肠癌COX2阳性表达组织作阳性对照；磷酸缓冲液及正常羊血清代替一抗分别作空白对照和替代对照。通过HPIAS 1000型高清晰度彩色病理图文分析系统，在同一光强度，同一放大倍数（200×）下，每张切片随机选取5个视野，以阳性物质像素的平均吸光度A值为参数，对切片上免疫组织化学阳性染色进行自动测量。② HXO RB44细胞的培养：HXO RB44细胞培养于含10%小牛血清的RMPI1640培养液内，垂直放于含5%CO2，37℃细胞培养箱内，HXORB44细胞体外呈悬浮生长，故采用半量换液法，每周1∶3传代两次。③NS 398对HXORB44细胞增殖的影响：取对数生长期的细胞，以每孔4×105个细胞接种于96孔板，培养2天。在细胞对数生长期，加入5个浓度的NS 398，分别培养24、48、72h。培养终止前4h，每孔加入0.1mg MTT，37℃孵育4h。弃去孔内上清液，每孔加入100μlDMSO。选择570nm波长，用酶联免疫检测盒测定各孔吸光度（A）值，细胞生长活力=试验组的A值/对照组的A值×100%。
1.4 统计处理 COX2表达的统计采用t检验。NS 398对细胞增殖的影响采用两因素的方差分析，各试验组与对照组的比较用q检验。
2 结果
2.1 COX2免疫组织化学染色 37例RB组织中，28例COX2阳性表达（75.7%），为细胞浆着色，呈黄色至棕黄色均匀细颗粒状。阳性细胞主要为肿瘤实质细胞，另外，血管内皮细胞亦可见阳性染色。
2.2 COX2表达与RB组织学分型的关系 37例RB组织中分化型19例，未分化型18例。经统计学检验，两型间COX2表达没有显著差异（P＞0.05），见表1。表1 COX2表达与RB组织学分型的关系
2.3 COX2表达与RB细胞浸润视神经的关系 视神经浸润组13例，无视神经浸润组24例，分化型与未分化型RB视神经浸润没有显著差异（P＞0.05），见表2。表2 COX2表达与RB浸润视神经的关
2.4 COX2选择性抑制剂NS 398对HXO RB44细胞增殖的影响 用5个浓度的NS398作用于HXO RB44细胞24、48、72小时后，用MTT法测定A值，结果见表3。采用两因素方差分析，比较结果得出NS 398不同浓度组和时间组之间A值不同（P＜0.05,P＜0.05）。采用q检验分别比较，发现50μmol/L, 100μmol/L, 200μmol/L试验组与对照组差异有显著性（P＜0.05, P＜0.01）。随着浓度增大，对HXORB44细胞的生长，增殖抑制作用更加明显。表3NS 398作用于HXO RB44细胞后的A值括号内为细胞生长活力，50μmol/L组与对照组差异有显著性（P＜0.05) 100μmol/L, 200μmol/L与对照组差异有极显著性（P＜0.01）
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