作者：黄敏丽，罗国容，陈维平，何少健，陈芳 作者单位：（530021） 中国广西壮族自治区南宁市，广西医科大学第一附属医院1眼科，2组织胚胎学教研室
【摘要】目的：观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响，初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法：采用细胞划痕实验测定tumstatin肽（T8肽）对血管内皮生长因子（VEGF）诱导下RF/6A细胞（恒河猴视网膜微血管内皮细胞）迁移的影响；Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15，30，45，60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。
结果：Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用，且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用，呈剂量依赖性。正常情况下，RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达，但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白，而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达（加入20mg/L T8肽30，45，60min时蛋白表达受到显著抑制，差异有显著性意义，P<0.01)。结论：Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，其作用可能与P38MAPK通路有关。
【关键词】 tumstatin；视网膜微血管内皮细胞；迁移；P38MAPK
The effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells
MinLi Huang, GuoRong Luo, WeiPing Chen, ShaoJian He, Fang Chen
Foundation items: Guangxi Natural Science Foundation of China (No. 0640090); Ph.D. Candidate Research Innovation Fund of Guangxi Educational Department, China (No. 2006105981001D13)
1Department of Ophthalmology,2 Department of Histology & Embryology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Correspondence to: MinLi Huang. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. [email protected]
AbstractAIM: To observe the effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells in vitro.
METHODS: Cell scratch healing assay was used to examine tumstatins interfering effect on the migration induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) in RF/6A cells (cell line of retinal microvascular endothelial cell of Macaca rhesus). The expression of P38MAPK protein was examined by Western blotting test at 15, 30, 45 and 60 minutes after VEGF was stimulated by tumstatin peptide.
RESULTS: Tumstatin peptide can inhibit the migration of RF/6A cells directly and can also inhibit the upregulated migration of RF/6A cells induced by VEGF. It was in dosedependent manner. There was no expression of P38MAPK protein in RF/6A cells in normal conditions, and VEGF could stimulate RF/6A cells to express P38MAPK protein, but tumstatin can inhibit the expression of P38MAPK protein induced by VEGF in RF/6A cells. CONCLUSION: Tumstatin can inhibit the migration of retinal microvascular endothelial cells. The inhibitory effect may be related to the signal path through P38MAPK. P38MAPK is not the only pathway; the knob of inhibition may be located in the upstream of P38MAPK.
KEYWORDS: tumstatin; retinal microvascular endothelial cells; migration; P38MAPK
引言
糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是较常见的致盲性眼病之一，其主要病变是视网膜新生血管形成。在新生血管形成过程中，血管内皮细胞迁移为较重要的环节之一，阻断此过程的发生能有效地抑制新生血管生成[1,2]。Tumstatin是新近发现的血管形成抑制因子，对肿瘤新生血管形成具有明显的抑制作用，且只作用于病理性的新生血管形成，而对发育和组织修复有关的新生血管形成无影响，是一种潜在的血管生成抑制剂，但其对视网膜微血管内皮细胞的作用尚未见报道[3]。本研究中，我们应用血管内皮生长因子（VEGF）诱导体外培养的视网膜微血管内皮细胞，而后应用tumstatin肽进行干预，采用细胞迁移试验和Western blotting分别检测细胞迁移和P38丝裂原激活蛋白激酶(P38MARK)蛋白表达的变化情况，试图从VEGF受体细胞信号转导通路角度初步探讨tumstatin抗视网膜内皮细胞迁移的机制。
1材料和方法
1.1材料
RF/6A细胞（恒河猴视网膜微血管内皮细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），TBD胎牛血清（天津灏洋生物公司），tumstatin肽（T8肽）（氨基酸序列为H KQRFTTMPFLFCNVND VCNFASRNDYSOH，纯度高于96%，上海波泰生物科技有限公司合成），VEGF（以色列CytoLab Ltd），兔抗P38MAPK多克隆抗体（Cell signaling公司），辣根过氧化物酶（HRP)标记的人抗兔IgG（美国R&D公司），甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）内参抗体（Santa Cruz公司），牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司），考马斯亮蓝（上海生物工程公司），化学发光底物系统（BeyoECL）（美国Pierce 公司），蛋白质Marker（预染）（含6条带：118，86，47，34，26，19kDa）（美国MBI公司），硝酸纤维素膜（美国Millipore）。
1.2方法
1.2.1细胞迁移划痕修复实验
实验分为T0，T5，T10，T20组（各组培养基中T8肽的浓度分别为0，1，5，10，20，40mg/L）以及V+T0，V+T5，V+T10，V+T20组（各组中均含有0.01mg/L VEGF，T8肽的浓度分别为0，1，5，10，20，40mg/L）。每组设3个平行孔，以3×105/孔的密度接种RF/6A细胞于六孔细胞培养板，用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。待细胞生长面积达90%后，改无血清的RPMI 1640培养液使细胞饥饿24h（使细胞基本同步化，在此期间处于非代谢状态，细胞主要处于G0～G1期）。采用200μL Tip头在孔中央对细胞作一个直的宽度约为0.8mm左右的划痕。无血清培养液将刮掉的细胞冲洗干净。沿划痕边缘等距离间隔作5个标记作为数据测定点，测量时取平均值。按分组加入实验试剂，置于37℃，50mL/L二氧化碳饱和湿度的温箱中继续培养。培养0，24，48h后置10×5倍的倒置显微镜下拍照记录。用病理图像分析软件测量各个时间点的划痕两侧的细胞间距离(μm)变化，以0h划痕边沿的距离减去各个时间点迁移边沿的距离来计算各个时间段视网膜微血管内皮细胞的迁移距离，反映细胞的迁移能力（图1，迁移距离=CFDE）。
1.2.2 Western blotting检测P38MAPK蛋白表达
实验分为T0（培养基中加入PBS）、T20（培养基中加入20mg /L T8肽）、V（培养基中加入0.01mg/L VEGF）和T20+V组（培养基中加入20mg /L T8肽及0.01mg/L VEGF）。取对数生长期的RF/6A细胞，稀释成1×109个/L，接种于50mm2的培养瓶中培养，每瓶5mL。待细胞贴壁后，按分组加入不同的培养液处理细胞15，30，45，60min。吸除培养液，PBS洗涤2次，加入预冷的细胞裂解液100μL，冰浴振荡30min裂解，转移至预冷的0.5mL离心管中，于4℃，12000g离心15min。上清液转移至另一0.5mL离心管中，用考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量。分装，70℃贮存。检测各组15，30，45，60min时P38MAPK蛋白表达量。实验结果进行灰度值扫描分析，采用Bandscan5.0软件统计吸光度值。
统计学处理：实验结果以±s表示，差异显著性采用方差分析（LSD法）或配对样本的t检验，样本均数间的两两比较采用StudentNewmanKeuls法，以P<0.05作为差异有统计学意义，统计分析采用SPSS10.0统计软件完成。
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