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2 结果
2.1 细胞迁移划痕修复实验
与T0组比较，V+T0组中RF/6A细胞24，48h迁移的距离较大，差异有显著性意义（P<0.01）；与T0组比较，T5，T10，T20组RF/6A细胞24，48h迁移的距离显著降低，且迁移距离随着T8肽浓度的增大而逐渐降低，各组比较差异均有显著性意义（P<0.01）；与V+T0组相比，V+T5，V+T10，V+T20组RF/6A细胞24，48h迁移的距离显著降低，且迁移距离随着T8肽浓度的增大而逐渐降低，各组比较差异均有显著性意义（P<0.01，表1)。表1 视网膜内皮细胞的迁移（略）
2.2 Western blotting检测P38MAPK蛋白表达
在T0组和T20组中均未检测到P38MAPK蛋白表达，而V组中加入VEGF刺激后，RF/6A细胞中P38MAPK被迅速激活，并持续升高，60min时蛋白表达量约为15min时的2倍（P<0.05)。与V组比较，T20+V组15min时P38MAPK蛋白表达量无显著性差异（P>0.05），而30，45，60min时蛋白表达受到显著抑制，差异有显著性意义（P<0.01)，30min时抑制率最大，为56.7%±1.7%（表2，图2）。表2 各组细胞不同时间P38MAPK蛋白表达量的对比（略）
3讨论
体外新生血管形成时，启动血管生成的步骤中不仅包括内皮细胞的增殖，还包括内皮细胞的迁移。研究表明，在视网膜新生血管性疾病中，视网膜内由于缺氧等病理因素的刺激，血管形成刺激因子如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子合成增加。这些因子刺激血管内皮细胞增生，而尿激酶型纤溶酶原激活基质金属蛋白酶并使其合成增加，从而导致细胞外基质降解和内皮细胞发生迁移[46]。我们的研究结果也显示，VEGF具有促进视网膜微血管内皮细胞迁移的作用，表现在V+T0组加入VEGF刺激后RF/6A细胞24，48h迁移距离显著大于T0组。
Tumstatin是人类IV型胶原的α3链的非胶原结构域1（NC1）功能区，是最新发现的来源于人基底膜胶原的血管形成抑制因子，具有有效的抗新生血管活性。Tumstatin主要有3个活性片段：Tum 5（指接近N端的54～132位氨基酸序列片段）、T7肽（指接近N端的74～98位氨基酸大约25个氨基酸的片段）和T8肽(指接近N端的69～95位氨基酸大约25个氨基酸的片段)，它们均具有与全长tumstatin同样的抗新生血管活性[7,8]。Hutchings等[9]研究表明，人脐静脉血管内皮细胞可以与培养皿中固定的VEGF的2种亚型VEGF165和VEGF189直接结合，这种结合受α3β1和αvβ3整合素调节，从而诱导内皮细胞的迁移和存活，而tumstatin能剂量依赖性地抑制VEGF与αvβ3整合素的结合，从而抑制内皮细胞的迁移；而抗αvβ3封闭性抗体可增强其抑制作用，提示VEGF与tumstatin竞争通过αvβ3的信号通路。在细胞迁移实验中，我们发现，加入不同浓度的T8肽后，RF/6A视网膜微内皮细胞迁移距离显著降低，说明tumstatin能抑制VEGF诱导的RF/6A细胞迁移，且成剂量依赖性。因此，我们认为，tumstatin抑制RF/6A视网膜内皮细胞迁移的作用可能也与tumstatin和VEGF竞争通过αvβ3的信号通路有关，具体机制需进一步研究阐明。
P38MAPK是由360个氨基酸组成的分子质量为38kDa的蛋白激酶，P38MAPK通路被称为应激激活的促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，主要增强细胞对应激原的抵抗力，并介导细胞凋亡的信号转导，同时调控细胞迁移，与细胞的应激、凋亡和迁移有关。多种外界信号如紫外线、渗透压、细胞因子、生理应激等均可激活P38MAPK，高血糖和糖尿病也可激活P38MAPK[10,11]。Wu 等[12]用20mg/L VEGF刺激人脐血管内皮细胞5min后，可以观察到有P38MAPK的磷酸化。我们的研究结果也显示，VEGF可以激活RF/6A细胞中的P38MAPK，表现在T0组未检测到P38MAPK蛋白表达，而V组中加入VEGF刺激后，P38MAPK蛋白被迅速激活而表达增加，与文献报道一致。我们推断VEGF诱导视网膜微血管内皮细胞的迁移是通过激活P38MAPK信号通路。Rousseau等[13]发现，在原代培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，VEGF增强HUVEC细胞迁移，同时显著诱导以张力丝形成和纽蛋白招募到黏着斑为特征的微丝网络结构的重组；用P38MAPK特异性抑制剂SB203580抑制P38MAPK活性可抑制热休克蛋白27（HSP27）磷酸化、肌动蛋白的重构和细胞迁移，而应用ERK激酶抑制剂PD98059抑制VEGF诱导的ERK激活后，肌动蛋白结构或细胞迁移并未受影响，提示P38MAPK途径在调节内皮细胞迁移中发挥重要作用。Lamalice等[14]也证实了VEGF处理内皮细胞后触发SAPK2/P38MAPK模块的激活，从而促进弹性纤维形成和内皮细胞迁移。我们研究显示，VEGF激活RF/6A细胞中的P38MAPK后，tumstatin可以显著抑制P38MAPK蛋白的表达，表现在与V组比较，加入T8肽的T20+V组中P38MAPK蛋白的表达在各时段均有不同程度的下降。因此，我们推断，当VEGF刺激引起VEGF受体（VEGFR）的活化，进而激活P38MAPK通路时，tumstatin可通过VEGFR信号转导通路抑制P38MAPK，从而抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移。
由于T0组和T20组中均未检测到P38MAPK蛋白表达，而无VEGF存在的情况下，tumstatin也能抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，因此我们认为tumstatin虽可能通过VEGFR信号转导通路抑制P38MAPK，进而抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，但P38MAPK可能并非抑制视网膜微血管内皮细胞迁移的唯一通路，或者P38MAPK也许只是抑制视网膜微血管内皮细胞迁移的下游通路，其抑制节点可能在P38MAPK的上游。
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12 Wu G, Luo J, Rana JS, et al. Involvement of COX2 in VEGFinduced angiogenesis via P38 and JNK pathways in vascular endothelial cells. Cardiovasc Res2006; 69(2):512519
13 Rousseau S, Houle F, Landry J, et al. p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene1997;15(18):21692177
14 Lamalice L, Houle F, Huot J. Phosphorylation of Tyr1214 within VEGFR2 triggers the recruitment of Nck and activation of Fyn leading to SAPK2/p38 activation and endothelial cell migration in response to VEGF. J Biol Chem2006; 281(45):3400934020 上一页 [1] [2] |
