作者：贾国荣，俞小瑞，李红波，王淑红，韩燕 作者单位：西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系，陕西西安 710061
【摘要】 目的 用流式细胞技术(FACS)检测H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡以及17β雌二醇(βE2)对细胞的保护作用。方法 取新生24h内的SD大鼠进行视网膜神经细胞的原代培养，待细胞培养4-5d，经不同因素处理后，用MTT法检测细胞存活率，用FACS法检测细胞凋亡率。结果 200μmol/L的H2O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡；低浓度的H2O2不能诱导细胞凋亡，但高浓度的H2O2诱导细胞凋亡的同时也导致了正常细胞比率的锐减；10μmol/L的βE2能有效对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡；低浓度的βE2对细胞未表现出保护作用，高浓度的βE2对细胞反而表现出毒性作用。结论 一定浓度的βE2在一定范围内能对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡，表现对神经细胞保护的作用。
【关键词】 17β雌二醇；H2O2；视网膜；凋亡；神经保护作用
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30672286)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2005 C261)
Protective effect of 17βestrodiol on retina neuron cell apoptosis induced by H2O2 by the method of FACS
Jia Guorong, Yu Xiaorui, Li Hongbo, Wang Shuhong, Han Yan
(Department of Genetics and Molecular Biology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To observe H2O2induced neuronal cell apoptosis and neuroprotection of 17βE2 by the technique of FACS. Methods The primary retina neuronal cells of neonatal SD rats which were born in 24h were cultured. After 4-5 days, we treated the cells using different factors, then observed the cell viability by MTT method and the cell apoptosis by FACS method, respectively. Results H2O2 treatment (200μmol/L) could effectively induce the cultured primary retina neuron cell apoptosis. The low concentration of H2O2 could not affect the cells, but the high concentration treatment could induce cell apoptosis, at the same time leading to normal cell decrease sharply; βE2 treatment (10μmol/L) showed neuroprotection on the primary cultured retina neuron cells, but the low concentration of βE2 had no effects, and the high concentration of βE2 manifested toxic action on the cells. Conclusion The limited concentration of βE2 shows effects of antiapoptosis and neuroprotection on the cultured primary retina cells.
KEY WORDS: 17βE2; H2O2; retina; apoptosis; neuroprotection
尽管大量的研究表明雌激素在大脑的正常发育、分化、神经功能的维持以及抗氧化、抗凋亡、抗损伤、防衰老等方面均发挥着重要的作用，但其作用的详细分子机制尚未阐明[13]。因此，有关雌激素在中枢神经系统中的作用研究已成为近年来神经科学研究的热点课题。视网膜是中枢神经系统的一部分。近20年来，许多研究均采用视网膜节细胞及视神经通路作为体内、外研究中枢神经系统损伤及再生的重要模型[45]，但有关雌激素在视网膜神经组织中的作用研究报道较少。本实验以离体原代培养的视网膜神经细胞为研究对象，用H2O2诱导凋亡，用MTT法测定细胞存活率，用FACS法测定细胞凋亡率，检测H2O2诱导凋亡的最佳浓度及雌激素的最佳保护浓度和预处理时间，为进一步研究雌激素在视网膜组织中的作用机制建立理想的研究模型。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 17β雌二醇购于Sigma公司，DMEM/F12培养液购于Hyclone公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，多聚赖氨酸购于华美生物工程有限公司，H2O2购于西安试剂厂，胰酶、DMSO和MTT均购于Ameresco公司，Annexin VFITC/PI购于晶美生物工程有限公司，24孔板购于Costar公司，二氧化碳培养箱(型号为forma 3110 seriesⅡ系列)及全波长酶标仪(型号为1500)均购于Thermo Electron Corporation，流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司(型号规格为FACS Calibur)。
1.2 原代视网膜神经细胞的培养 取10只新生24h内的SD大鼠，用75%(体积分数)的医用酒精溺死，超净台内无菌条件下摘取眼球，解剖显微镜下剥离视网膜组织，浸泡于DMEM/F12培养液中。将获得的视网膜组织吹打呈小碎块，用2.5g/L胰酶消化10min，200目筛网过滤，1000r/min离心5min，用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，倒置显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/mL，以1000μL/孔的量接种到铺有多聚赖氨酸的24孔板内，37℃，5%(体积分数)的二氧化碳培养箱培养。每隔24h给细胞做全量换液处理，在细胞培养的第4-5天后，用于试验研究。
1.3 MTT法检测细胞的存活率 原代培养的视网膜神经细胞，经不同因素干预之后，24孔板各孔中培养液终体积均为1000μL。向板内的各个孔中均加入浓度为5g/L的MTT 100μL，继续在37℃、5%(体积分数)的二氧化碳培养箱中培养4h后，小心吸弃孔内的全部液体，注意不要将孔底形成的颗粒吸掉，然后每孔加入750μL的DMSO，37℃摇床振荡10min，全波长酶标仪检测490nm波长处的A值。各实验组A值除以PBS对照组A值，再乘以100%，代表各实验组细胞存活率。
1.4 FACS方法检测细胞的凋亡率 原代培养的视网膜神经细胞，经不同因素干预后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，用Annexin VFITC/PI双染标记细胞(按试剂盒中说明书操作)，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.5 统计学分析 每组处理因素的样本数n=3，所有实验均独立重复了3遍，实验数据均用±s表示，用统计软件SPSS 15.0 进行单因素方差分析，以P<0.05时为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度的 H2O2对原代培养的视网膜神经细胞存活率的影响 为了研究不同浓度的H2O2对原代培养的视网膜神经细胞的影响，用含血清的DMEM/F12培养液将培养了4-5d的视网膜神经细胞换为含有不同浓度H2O2的无血清DMEM/F12培养液培养24h，然后用MTT法检测细胞的存活率。结果显示(图1)：100μmol/L的H2O2处理组对细胞的存活率没有显著的影响(P>0.05)，而200μmol/L的H2O2处理组能降低细胞存活率(P<0.05)，400μmol/L的H2O2处理组能使细胞的存活率显著降低(P<0.05)。
图1 不同浓度的H2O2对原代培养的视网膜神经细胞存活率的影响（略）
Fig.1 The effects of different concentration of H2O2 on cell viability of the cultured primary retina neuronal cells
*P<0.05 vs. PBS group (control)
2.2 不同浓度的 H2O2对原代培养的视网膜神经细胞凋亡率的影响 在同样的条件下，为了进一步精确研究不同浓度的H2O2诱导视网膜神经细胞凋亡的情况，我们选用FACS法检测细胞的凋亡率。结果显示(图2)：100μmol/L的H2O2处理组使细胞的凋亡率增加了5.9%(P>0.05)；200μmol/L H2O2处理组使细胞的凋亡率增加了20.8%(P<0.05)；400μmol/L H2O2处理组使细胞凋亡率增加了32.6%(P<0.05)。然而，400μmol/L的H2O2处理组在诱导细胞发生凋亡的同时也导致了正常细胞的锐减，因此，我们选择浓度为200μmol/L的H2O2作为诱导细胞凋亡的适宜浓度来构建视网膜神经细胞凋亡模型。
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