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2.3 不同浓度的βE2抵抗H2O2导致视网膜神经细胞死亡的作用 为了研究βE2抗H2O2导致细胞死亡的作用，用含血清的DMEM/F12培养液将培养了4-5d的视网膜神经细胞换为含有不同浓度βE2的无血清DMEM/F12培养液，培养30min后，加入200μmol/L的H2O2，继续培养至24h，之后用MTT法检测细胞的存活率(图3)。结果显示：单独H2O2处理组使细胞存活率降低了20%；各实验组和H2O2处理组相比较，0.1μmol/L的βE2预处理组使细胞的存活率升高了3.9%(P>0.05)；1μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率升高了8.9%(P<0.05)，10μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率升高了45.8%(P<0.05)，对细胞的保护作用最强；而50、100、200、300μmol/L以及400μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率下降了17.8%-77.7%，显示出这5种高浓度的βE2预处理组对细胞均无保护作用，反而表现毒性作用(P<0.05)。
图2 不同浓度的H2O2对原代培养的视网膜神经细胞凋亡率的影响（略）
Fig.2 The effect of different concentration of H2O2 on the apoptotic ratio of the cultured primary retina neuron cells
A: ① PBS as control; ② 100μmol/L H2O2; ③ 200μmol/L H2O2; ④ 400μmol/L H2O2; B: *P<0.05 vs. control, PBS group as control
2.4 不同浓度βE2对H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的作用 在相同条件下，为了进一步研究βE2对H2O2诱导的凋亡细胞的保护作用，我们用FACS法检测不同浓度的βE2预处理后，对抗H2O2诱导细胞凋亡的作用。结果显示：与单独的H2O2处理组相比较，3组浓度(0.1μmol/L，1μmol/L及10μmol/L)的βE2预处理30min均能使正常细胞所占比率明显增加(P<0.05，图4A)。但是，三组浓度的βE2预处理组之间，只有10μmol/L的βE2预处理30min组的正常细胞所占比率最多，细胞凋亡率最低(P<0.05，图4B)。此外，3组浓度(0.1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L)的βE2预处理60min组与单独H2O2处理组相比较，只有10μmol/L的βE2预处理组对细胞显示出保护作用(P<0.05)，而且10μmol/LβE2预处理30min和预处理60min两组对细胞的影响无显著性差别(P>0.05)。故在今后研究βE2抗神经细胞凋亡的详细分子机制过程中，拟将选择βE2的浓度为10μmol/L、预处理的时间为30min做为理想的研究条件。
图3 不同浓度的βE2抗H2O2导致视网膜神经细胞死亡的作用（略）
Fig.3 The effect of different concentration of βE2 on mortality of cultured primary retina neuron cells induced by H2O2
*P<0.05 vs. H2O2 group
3 讨论
氧化损伤是引起神经细胞兴奋性损伤的一个主要原因，虽然有文献报道了雌激素具有对抗神经细胞凋亡的作用[67]，但有关雌激素对氧化应激诱导的视网膜神经细胞凋亡的作用报道较少。本研究以原代培养的视网膜神经细胞为研究对象，用H2O2诱导细胞凋亡，用双染标记(Annexin V/PI)的流式细胞技术检测和分析凋亡细胞。结果发现200μmol/L的H2O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡，成功构建了体外神经细胞凋亡模型；同时，研究发现10μmol/L的βE2预处理30min能显著地降低H2O2诱导的神经细胞凋亡，表现出明显的神经细胞保护作用。
图4 不同浓度的βE2对H2O2诱导的细胞凋亡的作用（略）
Fig.4 The effect of different concentration of βE2 on apoptotic ratio of cultured primary retina neuron cells induced by H2O2
A: ① PBS ; ② H2O2: 200μmol/L; ③ E2: 0. 1μmol/L (30min)+H2O2: 200μmol/L(24h); ④ E2: 1μmol/L(30min)+H2O2: 200μmol/L (24h); ⑤ E2: 10μmol/L (30min)+H2O2: 200μmol/L (24h); B: *P<0.05 vs. H2O2 group
本研究选用新生乳鼠视网膜组织，可以排除由于年龄、环境等外界因素而导致的视网膜自发性退行性变，从而使研究模型更真实、研究结果更可靠。应用双染标记的流式细胞分析技术检测和分析结果，能定量的获得和区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞的比率。与常规检测细胞活力的MTT法相比较，结果更直观、精确、可靠；与其他两种常用的定量检测细胞凋亡的技术如：早期的PI染色法和目前的TUNEL法相比，双染标记的流式细胞分析法更具优势。早期常用的PI染色法错检率和漏检率都较高；TUNEL法的缺点是坏死细胞亦呈现TUNEL反应阳性，使其检测细胞凋亡的特异性降低[8]。此外，双染标记的流式细胞分析术不需要固定细胞,避免了PI法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失的问题，操作更省时，实验结果更可靠，更具说服力。
本阶段的实验研究为进一步研究雌激素神经保护作用的机制奠定了坚实的基础。今后，我们将从雌激素作用的信号转导途径研究雌激素抗神经细胞凋亡的分子机制，为临床应用雌激素治疗神经退行性疾病提供治疗靶点。
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