作者：陈丽华 江萍 胡学斌 莫纯坚 王红俊 王静 甘绪芹    作者单位：三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院，湖北 宜昌 443003

　　【摘要】  目的 探讨大鼠角膜新生血管中内皮素1(endothelin-1,ET-1)和血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表达和意义。方法 采用角膜缝线建立角膜新生血管模型。裂隙显微镜观察角膜新生血管的生长情况；用免疫组织化学技术检测ET-1及VEGF在角膜新生血管模型不同阶段的表达和变化。结果 实验鼠于缝线后3 d开始形成新生血管并见炎性细胞浸润，12 d角膜新生血管面积达高峰，12 d后新生血管和炎性细胞均明显减少。免疫组化显示ET-1和VEGF于缝线后1 d表达开始升高，9 d达高峰，以后逐渐下降,两种因子的表达与CNV的面积具有正相关性(ET-1与CNV的r值为0.807，VEGF与CNV 的r值为0.779,P＜0.05)。结论 大鼠角膜ET-1和VEGF的表达与新生血管的形成有相关性，并在其中发挥重要的作用。

　　【关键词】  内皮素1；血管内皮生长因子；角膜新生血管；免疫组织化学

　　角膜新生血管(corneal neovascularization ，CNV)的形成严重影响角膜透明性，是最常见的致盲原因之一，也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。CNV发生机制虽然不清，但诸多生长因子、细胞因子和炎症介质发挥的作用一直是研究关注的重点，其中新生血管刺激因子的过度表达是其发生的基础。血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）是目前研究发现的功能最强的血管形成刺激因子，大量资料证实VEGF在血管形成中起重要作用〔2～4〕，故抑制角膜组织VEGF 的表达可能成为抑制血管形成的新途径。内皮素-1(endothelin-1，ET -1)是具有多种生物学活性的一种多功能细胞因子，最近研究表明ET-1与肿瘤血管的发生密切相关。但ET-1在角膜新生血管形成过程中的作用如何，与VEGF 在CNV形成中的关系目前尚不清楚。本实验采用角膜缝线诱导建立大鼠CNV模型，检测缝线诱导角膜新生血管术后不同时间点ET -1和VEGF表达的动态变化并分析其与CNV的关系，探讨CNV有关发病机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  模型的建立  健康雄性SD大鼠36只，体重220～250 g，华中科技大学同济医学院动物实验中心提供(许可证号：SCXK〔鄂〕2004-0007，级别：SPF)。经3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)全身麻醉后，检查所有鼠眼无眼前节病变，用0.25%氯霉素眼药水冲洗结膜囊，常规消毒，复方托品酰胺散瞳，0.5%丁卡因表面麻醉。在手术显微镜下用 10-0 聚胺酯缝线在右眼上方角膜象限间断缝合3 针（11 点、12 点、1 三个钟点位置），自距离角膜缘略小于 2.0 mm（圆规定位）向瞳孔中心方向进针，穿过角膜基质约1.5 mm，线距1 mm，缝线头长约1 mm。缝针尽量避免进入前房。术后双眼均每日滴0.25%氯霉素眼液3次。根据缝线后1、3、6、9、12及15d 随机分成6组，每组6只。右眼为实验组，左眼为正常对照组。

　　1.2  角膜新生血管形态学观察及面积计算  自缝线后第1天开始，每日在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管生长情况，并用圆规测量长入角膜的新生血管长度（以连续且弯曲度小、并与角膜缘切线垂直的最长血管为准）计算CNV生长面积(A)〔1〕:A=C/12×3.1416〔r2-(r-l)2〕,其中C为CNV累计角膜的圆周钟点数，l为CNV从角膜缘伸入角膜的长度，r(鼠角膜半径)=3.75 mm。

　　1.3  角膜组织病理学检查  相应时段过量麻醉处死大鼠，取眼球置于 10% 中性福尔马林固定24 h，常规上脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，苏木精-伊红染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

　　1.4  免疫组织化学检测ET-1和VEGF的表达  石蜡切片脱蜡30 min，梯度乙醇透明，切片置于枸橼酸钠缓冲液中行微波抗原修复10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次5 min。按SP试剂盒说明进行免疫组织化学操作，一抗为兔抗ET-1和 VEGF多克隆抗体（VEGF一抗由福建迈新公司提供，ET-1由北京博奥森生物技术有限公司提供）,二抗为抗兔S-P试剂盒(福建迈新公司)。经二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素衬染、透明、脱水、封片。阴性对照以PBS代替一抗,其他条件均相同。抗ET-1、VEGF抗体染色阳性的细胞胞浆或胞膜呈程度不同、基本均匀的棕黄色粗大颗粒反应，反之则为染色阴性。采用Leica Qwin图像分析系统对每张免疫组化切片随机选取5个不重复的高倍视野(×400)，利用Image-Pro Plus5.0图像分析软件分析阳性的平均灰度值(0～255范围内，灰度值与染色强度呈反比)，求出平均积分光密度(average integrate optical density，AIOD)，AIOD值与阳性区域的面积和着色深浅呈正比，即AIOD值越大，代表蛋白含量越高。

　　1.5  统计学分析  数据采用SPSS10.0软件进行分析，实验结果均以x±s表示，行单因素方差分析，对VEGF和ET-1的表达及其与CNV的面积之间的关系进行Spearson相关分析。

　　2  结果

　　2.1  免疫组织化学分析  见表1。在正常角膜中，ET-1在角膜上皮层和内皮层有少量表达，而VEGF仅在上皮基底膜有微弱表达。缝线后不同时期，ET-1和VEGF在角膜上皮全层、基质层炎性细胞（主要为多形核中心粒细胞）和角膜新生血管内皮染色均为阳性，表现为细胞胞浆或胞膜呈棕黄色粗大颗粒反应（图1A～C和图2A～C）。图像分析结果显示，ET-1和VEGF在缝线后1 d开始升高，9 d达高峰，12 d后开始回落。各组与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两种因子的表达与CNV的面积具有正相关性(VEGF与CNV 的r值为0.779，ET-1与CNV的r值为0.809,P＜0.05) 。

　　表1  大鼠缝线后不同阶段角膜中ET-1和VEGF的AIOD变化（略）

　　与对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01

　　A为正常对照组，胞浆或胞膜内见ET-1弱阳性反应；B为缝线后3 d组，ET-1在角膜上皮全层、基质层炎性细胞和角膜新生血管内皮均见阳性反应；C为缝线后9 d组，角膜组织中ET-1呈强阳性反应。

　　图1  大鼠缝线后不同时间角膜组织中ET-1的表达（SP法，×400）（略）

　　A为正常对照组，在角膜上皮层（尤以基底膜细胞）有微弱表达；B为缝线后3 d组，VEGF在角膜上皮全层、基质层炎性细胞和角膜新生血管内皮均见阳性反应；C为缝线后9 d组，角膜组织中VEGF呈强阳性反应。

　　图2  大鼠缝线后不同时间角膜组织中VEGF的表达（SP法，×400）（略）

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