2.2  角膜新生血管形态学观察及面积  正常角膜可见角膜缘血管网呈环状围绕角膜一周；角膜缝线后1 d可见缝线处基质轻微水肿，角膜缘血管网轻度扩张；3 d后在缝线区可见角膜缘附近有明显的新生血管芽生成，长约1 mm，呈细毛刷状，整齐且密集，基质明显水肿；第6天时新生血管已达到或超过缝线的近角膜缘端，血管生长旺盛，出现分支状吻合，基质水肿未减轻；第9天可见新生血管延伸到达或超过缝线位置；第12天角膜新生血管伸入缝线周围甚至达缝线顶端，管径增粗，基质水肿减轻；15 d后角膜新生血管密度降低，血管分支减少，管径变细。对缝线后不同时间CNV面积进行单因素方差分析显示，各不同时间点有显著差异(F=665.05，P＜0.01)。均数的两两比较显示，除了缝线后12 d与15 d没有统计学差异（P=0.23），其余各时间点比较有显著性差异（P＜0.01）（表2）。

　　表2  大鼠缝线后不同时间CNV面积（略）

　　2.3  角膜组织病理学改变  正常角膜上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层结构完整、清晰。角膜缝线后第1天，缝线周围成纤维细胞及炎性细胞(中性粒细胞、淋巴细胞)聚集。角膜缘有大量炎性细胞浸润，角膜基质未见CNV形成；第3天，角膜炎性细胞浸润在角膜缘到缝线之间，该处角膜前部基质已有CNV形成，管腔中度大小，由单层内皮细胞围成，腔内充满红细胞；至第6～9天，角膜前部基质CNV数明显增多；第12天，炎性细胞仍较多，新生血管管腔增粗，腔内含有红细胞，管腔壁变厚，血管内皮细胞更加成熟。第15天，新生血管和炎性细胞均明显减少，新生血管内皮细胞变性，血管腔塌陷。

　　3  讨论
   
　　ET-1是1988年Yanagisawa等〔2〕首先从猪主动脉内皮细胞培养上清液上分离纯化出的一种活性多肽，通过激活与受体相耦联的G蛋白起作用。ET-1不仅具有强烈的缩血管活性，而且还是一种血管生成因子，可参与内皮细胞增殖、蛋白酶释放、基底膜降解、内皮细胞黏附及迁移和新的毛细血管形成等各个血管生成阶段〔3〕。近年研究表明，ET-1与肿瘤血管的发生密切相关。但ET-1在CNV形成过程中的作用如何目前尚不清楚。
   
　　Bek等〔4〕用角膜囊袋法诱导大鼠角膜新生血管生成时发现，含20～1 000 ng ET-1的缓释剂药丸能成功诱导大鼠的角膜新生血管形成，证实一定量的外源性ET-1可以诱导CNV形成。进一步研究表明，ET-1诱导的大鼠角膜新生血管形成可以被内皮素受体阻断剂波生坦有效地抑制，提示ET-1直接参与大鼠角膜新生血管的形成。另外，Kuhlmann等〔5〕用免疫组织化学及原位杂交等方法证实，在新生血管形成的人角膜中ET-1的表达明显高于正常人角膜，据此认为，ET-1与角膜新生血管形成有关。本实验结果显示：ET-1 蛋白免疫组织化学阳性染色主要分布在基质层浸润的炎性细胞和新生血管内皮细胞胞浆中，呈棕黄色颗粒，新生血管形成组阳性表达率明显高于正常对照组，说明ET-1参与了角膜新生血管的形成，这与Kuhlmann 等〔5〕人的研究结果一致。
   
　　VEGF 是目前已知的最关键的血管生成因子，能够高度特异性地与血管内皮细胞膜上的受体结合，刺激内皮细胞的分裂、增殖、迁移，最终导致新生血管的形成，是角膜新生血管化过程中一种重要的因子，有较强的血管通透性，是目前发现的对血管内皮细胞最具选择性的有丝分裂原。本研究发现在正常角膜中VEGF在上皮基底膜有表达，而在新生血管形成的角膜中VEGF 主要表达于炎性浸润细胞，表达的强弱与炎性细胞的数量有关。我们推测，在角膜复杂而又精细的因子网络中，VEGF 可能对维持正常角膜生理功能起一定的作用，而角膜一旦损伤VEGF 分泌显著增多，积极地参与损伤修复，活跃地促进角膜新生血管化反应。
   
　　本研究结果显示，ET-1的表达在缝线后第1天即迅速提高，第9天达高峰，第12天已迅速下降，与VEGF的表达变化趋势完全一致，提示两者之间存在一定的协同关系，ET-1可能通过直接或间接的方式(如低氧诱导因子-α等)上调VEGF合成并与其相互协同促使CNV生成，但关于ET-1与VEGF是如何相互协同促使CNV生成的具体机制有待进一步研究。
   
　　本实验发现，尽管在ET-1和VEGF蛋白表达的变化趋势与CNV面积变化趋势相似，并且两种因子的表达与CNV面积呈正相关；但是我们从角膜新生血管形态学可以观察到，CNV生长高峰为12 d，其峰值晚于ET-1和VEGF蛋白的表达峰值，说明ET-1和VEGF与CNV生成具有密切关系，是CNV的促发因素。因此，通过抑制ET-1的生成，有望成为抗角膜新生血管治疗的又一个靶点。

　　【参考文献】

　　1 Kawai K,Yamada M，Haa Y,et al.The role of cyclooxgenase-2 induced by chemical cautery in corneal angiogenesis in the rat〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998;39(4):S743.

　　2 Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells〔J〕.Nature,1988;332:411.

　　3 Boldrini L，Pistolesi S，Gisfredi S,et al.Expression of endothelin 1 and its angiogenic role in meningiomas〔J〕.Virchows Arch，2006;449(5):546-53.

　　4 Bek EL,Micmillen MA.Endothelins are angiogenic〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2000；36（Suppl5）：s135-39.

　　5 Kuhlmann A,Amann K,Schlotzer-Schrehardt U,et al.Endothelin-1 and ETA/ETB receptor protein and mRNA：expression in normal and vascularized human corneas〔J〕.Cornea，2005;24(7):837-44.

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