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胎儿角膜深低温保存对FAS/FASL蛋白表达的影响

http://www.cnophol.com 2009-12-28 14:59:15 中华眼科在线

  作者:马路生    作者单位:(264000)中国山东省烟台市,青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院眼科

  【摘要】  研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后胎儿角膜的表达情况。

  方法:应用免疫组织化学SABC法对33例不同胎龄(5mo至足月)胎儿角膜石蜡标本切片后,分别进行了Fas和FasL 蛋白染色。结果:胎儿角膜细胞Fas蛋白及 FasL蛋白全为胞质和/或胞膜着色。33/33例角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白阳性表达,经统计学分析,未发现不同月龄间有差异。33/33角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白阳性表达,经统计学分析,未发现不同月龄间有差异,角膜基质细胞FasL蛋白的表达为0/33。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas,FasL蛋白阳性表达量经统计学分析无差别。结论:新鲜和深低温保存后的5mo至足月龄胎儿角膜均可见Fas,FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质和内皮细胞均表达,FasL在角膜上皮、内皮细胞表达,而基质细胞不表达。深低温保存对胎儿角膜Fas/FasL蛋白表达无影响。

  【关键词】  Fas蛋白 FasL蛋白 凋亡 角膜

  0引言

  细胞凋亡是深低温保存过程中角膜细胞丧失的重要原因,Fas/FasL是新近发现的与角膜细胞凋亡密切相关的一对基因,深低温保存能否促进人角膜Fas/FasL表达的增加,目前尚未见报道。鉴于成人角膜来源困难,我们选取胎儿角膜作为研究对象,对此进行了初步研究。

  1材料和方法

  1.1材料

  青岛医学院第二附属医院眼库1998/1999年收集胎儿角膜33例,男胎21例,女胎12例,5mo龄6例,6mo龄6例,7mo龄6例,8mo龄5例,足月龄10例。平均(7.17±1.77)mo,将角膜一分为二,一半经由简易二步法深低温保存[1],复温后行40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,5μm切片,另一半则为新鲜标本直接用 40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,5μm切片。角膜冷冻时间从1wk~10mo,平均冷冻时间为(5.12±3.47)mo。Fas,FasL蛋白染色所需试剂,采用武汉博士德公司分装的即用型FAS试剂盒和FASL试剂盒。深低温保存角膜所需试剂,主要有二甲基亚枫、人血白蛋白及液氮。

  1.2方法

  采用即用型SABC 法。阳性对照:用Fas,FasL试剂盒中自带阳性对照片做阳性对照;阴性对照:用PBS代替一抗作为阴性对照。以细胞膜和/或细胞质有清晰棕黄色颗粒着色为阳性染色细胞,胞膜或胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。在同一放大倍数下,根据阳性细胞的分布范围,分为0:阳性细胞数为0%;1:1%~25%;2:26%~50%;3:51%~75%;4:76%~100%。每张切片随机取3个视野,上皮、基质和内皮分别统计。
   
  统计学处理:采用SPSS10.0软件,根据资料性质,分别采用完全随机设计资料的方差分析和t检验。

  2结果

  2.1 Fas,FasL蛋白表达

  Fas/FasL 蛋白阳性染色主要定位于细胞膜和细胞浆,呈棕黄色,而细胞核不着色,于是着色细胞便出现浆膜着色而核空的现象。Fas蛋白在角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞均有表达,FasL蛋白仅在角膜上皮细胞和内皮细胞有表达。上皮细胞层以翼状细胞和基质细胞着色更为明显(图1)。

  2.2不同月龄及深低温保存的影响

  阳性对照片可见明显的阳性细胞,阴性片未见细胞有棕黄色颗粒表达。本实验33/33 例胎儿角膜Fas蛋白在3层细胞均阳性染色,着色颗粒均匀一致弥漫分布于细胞质和细胞膜,但有些角膜其细胞膜和细胞质可见大量的着色颗粒,而有些角膜其细胞膜和细胞质的着色颗粒则较少或无。不同月龄角膜Fas 蛋白表达无差异,冷冻保存后Fas蛋白表达亦未见明显差异(表1)。本实验33/33例FasL蛋白阳性染色,角膜上皮细胞和内皮细胞均着色,着色颗粒均匀一致,弥漫分布于细胞质和细胞膜,其中有些标本其细胞质和细胞膜可见大量的着色颗粒,有些角膜其细胞膜和细胞质的着色颗粒则较少。所有角膜基质细胞均不着色。不同月龄间角膜FasL蛋白表达无差异,冷冻保存后FasL蛋白的表达亦无显著改变(表2)。表1胎儿角膜Fas蛋白表达情况(略)表2胎儿角膜FasL蛋白表达情况(略)

  2.3 Fas/FasL表达与性别关系

  差别无显著性(P>0.05),胎儿角膜Fas/FasL蛋白表达与性别无关(表3)。表3胎儿角膜Fas/FasL表达与性别的关系(略)

  3讨论

  Fas是新近发现的细胞凋亡的信号分子[2,3],FasL是新近发现的细胞凋亡因子,二者构成了一条独特的细胞凋亡通路,在角膜细胞的凋亡过程中起重要作用。深低温保存为眼库的主要保存技术,其能否激活Fas/FasL细胞凋亡通道,增加保存过程中的角膜细胞凋亡数量,既往多见于动物实验,尚未见人角膜方面的报道[4]。

  关于Fas/FasL在胎儿角膜是否表达,不同月龄间有无差异未见报道。本研究结果,5mo龄以后胎儿角膜Fas,FasL的表达率为33/33,33/33,经统计学分析5mo至足月龄间Fas/FasL表达率无差别(P>0.05)。本研究具体到各月份例数尚少,可能不能代表群体情况,但至少在本实验所用33例角膜标本未见差异。我们发现,从5mo龄胎儿角膜直至足月胎儿角膜上皮、基质和内皮细胞Fas均持续表达,FasL在角膜上皮和内皮细胞均持续表达。Wilson等[5]采用逆转录聚合酶链反应研究发现,新鲜及冷冻的人角膜上皮、基质、内皮细胞全有Fas蛋白,而FasL蛋白仅发现于角膜上皮和内皮细胞,在角膜基质细胞没有发现,与本研究结果相同。本研究结果提示,胎儿角膜已具备与成人角膜 相近的“免疫赦免的物质基础”,为胎儿角膜移植的临床应用提供理论基础。

  【参考文献】

  1王传富,鞠明诚,石珍荣,等.简易法深低温保存角膜的实验和临床评价.眼科研究 1990;8:206209

  2 Yonehara S, Ishii A, Yonehara M. A cellkilling monoclonal antibody (antiFas) to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med1989;169:17471756

  3 Trauth BC, Klas C, Peters AM. Monoclonal antibodymediated tumor regression by induction of apoptosis. Science1989;245:301305

  4胡红莉,尹莉莉,管怀进.白内障患者晶状体上皮细胞中Fas蛋白的表达.国际眼科杂志 2008;8(2):252254

(来源:互联网)(责编:xhhdm)

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