1 材料和方法
1.1 QU眼膏的制备 称取QU(美国sigma公司)200 mg置于灭菌乳钵中研磨成极细粉末,加入少量灭菌液体石蜡,继续研磨成糊状,然后加入少量灭菌眼膏基质(眼膏基质的组成为黄凡士林8份,液体石蜡1份,羊毛脂1份)至总重量达20 g,研磨均匀即得。用无菌软管分装。
1.2 实验动物及分组 选用健康新西兰大白兔,雌雄兼用,体重1.8~2.5 kg,由重庆医科大学实验动物中心提供。54只兔眼分三组,每组18只兔,行标准小梁切除术。A组术后给眼膏基质;B组术后予QU眼膏;C组术后不给予特殊处理。
1.3 模型制备 所有手术实验动物采用速眠新(复合麻醉剂)1.0~1.5 g/kg肌注麻醉,选择兔鼻上或颞上象限做以穹隆为基底的结膜瓣,行标准小梁切除术。术毕结膜下注射庆大霉素2万U,地塞米松2.5 mg。A、B两组术后立即给予相应眼膏并包扎,并于第2日起每日用药两次(每日早9 点和晚9点),直至处死动物。术后3 d内林可霉素眼液点眼,每日三次。
1.4 术后大体及裂隙灯检查 术后每日在裂隙灯显微镜下观察术眼结膜、滤过泡、角膜、前房及晶状体并记录。根据滤过泡高度及其环绕角巩膜缘的范围,用数值表示滤过泡大小,以便分析。滤过泡高度分为0~4分,0分示滤过泡消失,4分示滤过泡极高。滤过泡范围按环绕角巩膜缘的范围记分,即0~12分。滤过泡实际得分为滤过泡范围的分数加上滤过泡高度的分数。每个滤过泡可得0~16分。
1.5 组织病理学和免疫组化学检查 分别于术后第1周、第2周、第4周,向耳缘静脉注入空气处死各组各3只兔子,迅速摘除眼球,取5 mm × 5 mm滤过道处组织,用10%多聚甲醛固定,按常规石蜡包埋,5 ?滋m厚连续切片。
1.5.1 苏木素-伊红染色法
主要观察不同时间各组滤过道的开放情况,及炎症细胞的浸润、成纤维细胞的生长。
1.5.2 Masson三色染色法检测胶原含量
切片制作方法同上,切片脱蜡至水,苏木素染5~10 min后盐酸酒精分化,置丽春红品红酸性溶液中染色5~8 min,蒸馏水冲洗,再用1%磷钼酸染1~3 min,直接浸入苯胺蓝液中5 min,迅速用水洗净,透明、中性树胶封片。
计算机图像分析仪(成都金盘多媒体图像处理系统)测量5个视野巩膜瓣下阳性积分光密度和管壁的面积,计算其平均值,即平均光密度(OPTEM),相对反映滤过平面的滤过道阻塞程度,将两组平均光密度值进行比较。
1.5.3 链酶亲和素免疫组化法(SABC法)检测转化生长因子(transforming growth factor,TGF)TGF-β1和TGF-βR1
切片常规脱蜡,下行水化。按SABC法步骤做免疫组化检查TGF-β1和TGF-βR1。一抗分别是1∶100的TGF-β1和TGF-βR1,用PBS代替一抗做阴性对照。实验所用抗体和SABC试剂盒均为武汉博士德公司产品。
结果采用金盘多媒体图像处理系统。测定条件:物镜放大倍数为20×10,每张切片随机测定5个视野的阳性染色密度,取5个视野的均值为结果。
1.6 统计学方法 所得数据以x±s表示,采用t检验分析。
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