中华眼科杂志 1999年第3期第35卷 病例报告
作者：叶俊杰 张美芬 李维业 王筠 胡天圣
单位：叶俊杰 张美芬 李维业 胡天圣（100730中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科）；王筠（美国国立眼科研究所）
急性视网膜坏死(acute retinal necrosis,ARN)是疱疹族病毒感染所致的视网膜炎。表现为广泛视网膜全层坏死，病情进展迅速。可发生于任何年龄。65%的患者双眼发病，80％～85％的患者出现视网膜脱离，短期可导致失明。ARN主要为单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus1,HSV1)或水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)感染所致。HSV1和VZV有各自敏感的抗病毒药物，因此，确切的ARN病因学诊断至关重要。采用脉络膜视网膜活检术能够直接获取感染组织，并通过分子生物学技术进行病因学鉴定。我们于1996年收治1例急性视网膜坏死患者，并行脉络膜视网膜活检联合玻璃体切除术，活体取材标本经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测，证实VZV感染是本例ARN的病因。
一、病历简介
患者女，58岁。因左眼视力急剧下降1月余，曾在外地医院分别诊断为“左眼葡萄膜炎、眼底出血”，“左眼ARN”。经用地塞米松、庆大霉素球周注射1周无效，视力继续下降，改用无环鸟苷治疗，病情仍进行性加重。继而右眼出现前节炎症及玻璃体视网膜病变，视力迅速下降至0.4，再增加无环鸟苷剂量，病情继续恶化。于1996年12月26日到我院就诊，诊断为“双眼ARN，左眼视网膜全脱离”。增加口服无环鸟苷剂量，每次500mg，每日5次，但双眼病情仍继续恶化，故收入院治疗。患者曾患非胰岛素依赖型糖尿病9年，经口服优降糖和盐酸二甲双呱药物，血糖控制良好。
入院体检未见异常。实验室检查：空腹血糖8.3mmol/L。眼部检查：右眼视力0.4-1,左眼无光感。双眼角膜后有大小不等的灰白色KP(++)，房水闪光(++)。眼底散瞳检查见右眼玻璃体有尘埃状混浊；后极部小片状出血（图1），视网膜颞上支动脉旁有多处白色斑块病损，远端呈白线（图2）。左眼晶体密度增高；玻璃体重度混浊；视盘隐约可见，视网膜可见黄白色坏死区（图3)。B超检查：玻璃体混浊机化，视网膜广泛牵拉性脱离。鉴于患者对无环鸟苷治疗无效，考虑有VZV感染的可能。遂于1997年1月3日起改用丙氧鸟苷250mg静脉点滴，每12小时1次，持续3周；以后改为250mg，每日1次，持续4周。同时，行左眼脉络膜视网膜活检及玻璃体切除术。同日于右眼玻璃体内注射丙氧鸟苷400μg，以后每5日注射1次，共4次。口服肠溶阿斯匹林50mg，每日2次。经上述治疗后第10天，视力增进至1.0。玻璃体透明，后极部视网膜出血吸收，颞上支动脉白线和周围视网膜白色病损区消失。术后第13天，角膜透明，KP(－)；房水闪光(－)。术后第24天，视力达到1.2。随诊1年9个月，视力保持在1.0，眼底正常（图4,5）。左眼术后视网膜全部复位，活检部位边缘有色素沉着。至今病情稳定，无并发症。
二、脉络膜视网膜活检及玻璃体切除术
对患者左眼施行玻璃体切除及脉络膜视网膜活检术。沿角膜缘360°剪开球结膜，用4-0丝线做4条直肌牵引。标准的3点式睫状体平坦部切开后行晶体粉碎术。玻璃体切除时发现视乳头苍白萎缩；视网膜全部脱离，多发性网状视网膜裂孔；视网膜动脉呈白线；周边部视网膜有多处白色坏死病灶。切除视轴区、后部玻璃体和玻璃体基底部之后，将鼻上象限周边部视网膜有活动性病变区域作为活检部位，并行眼内激光光凝术。活检范围约6mm×6mm，沿其边缘部位光凝2排。在巩膜外定位标记出活检部位，然后于鼻上象限，距角膜缘5或6mm，向后极部做一6mm×6mm近全层的巩膜瓣。沿此巩膜瓣内缘再行2排穿透脉络膜和视网膜的电凝。关闭灌注液后，用尖刀片1次切穿脉络膜、视网膜，进入玻璃体腔。夹住病变组织边缘，将全层脉络膜与视网膜切下，活检标本约4mm×4mm。巩膜瓣复位，9-0尼龙线行巩膜瓣间断和连续缝合，至无液体渗漏为止。手术过程中，眼内林格氏灌注液中含有丙氧鸟苷4μg/ml，总用量为2000μg。气/液交换后，视网膜全部复位，再补加激光光凝，并行下方虹膜周边切除。玻璃体腔内注入硅油约4.6ml。7-0vicryl可吸收线8字缝合睫状体平坦部切口。活体组织标本切成2块，同时浸泡在2.5%戊二醛固定液中。
三、VZV的DNA检测
将其中一块戊二醛固定的视网膜活检组织移至200μl双蒸溜水中煮沸15min，离心14000r/s，共10s，收集上清液做PCR。
根据VZV的DNA顺序设计如下引物和探针。第1组引物：TK4,5′-GAG-GAA-GTT-GAA-GCC-ACA-TC-3′；TK5,5′-GAA-GGT-CAA-GGT-TGG-TTG-GC-3′。PCR产物：249bp。第2组引物：PL1,5′-GGA-CTT-TCC-ACG-GGA-GAT-AT-3′；PL2,5′-AGT-TCC-GCG-CTG-CAG-GTT-CC-3′。巢式(Nested)PCR产物：166bp。反应液中含有1×PCR缓冲液，4种底物(dATP+dCTP+dGTP+dTTP),各200μmol/L;MgCl22.5mmol/L;TaqDNA聚合酶2.5U；引物0.2nmol/L至1μmol/L;模板DNA20～50ml。DNAPCR循环参数如下：95℃，1min；94℃，15s；58℃，15s；72℃，30s；(35～40循环次数)；72℃，7min；之后保持在4℃。
应用琼脂糖(agarose)凝胶电泳与溴化已锭(ethidium bromide，EB)染色检测PCR产物。从VZV感染的RPE细胞中提取VZVDNA作为阳性对照。VZV感染的RPE细胞经2.5%戊二醛溶液固定后，作为固定组织阳性对照，以证实2.5%戊二醛对PCR检测无影响。同时应用PCR检查HSV1的特异DNA。
用Southern印迹法(Southernblot)与斑点印迹法(Dotblot)对从活检组织提取的DNA进行双重检测，进一步证实PCR的特异性。Southernblot和Dotblot方法均使用VZV探针，序列为5′-GCC-TAC-GGG-ATG-GTG-CAT-AC-3′，具体方法见Sambrook等［1］描述。
从患者视网膜活检组织标本中检测出VZV的特异DNA，而检测HSV1DNA为阴性。证实本例确为VZV感染所致的ARN。
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