中华眼科杂志 1999年第3期第35卷 青光眼
作者：吴永青 葛坚 邱鹏新 李艳艳 林明楷 郭彦
单位：吴永青 葛坚 李艳艳 林明楷 郭彦（510060广州，中山医科大学中山眼科中心眼科医院）；邱鹏新（药理学教研室）
关键词：视网膜神经节细胞；细胞；培养的；细胞纯化；抗原Thy-1.1；青光眼
【摘要】 目的 建立体外视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）培养和纯化模型。方法 出生后1～3天Sprague-Dawley(SD)乳鼠，RGCs在basal medium eagle(BME)培养基中培养，相差显微镜下观察细胞生长规律。羊抗鼠单克隆抗体FITC-Thy-1.1鉴定RGCs，并通过Thy1.1单抗进行RGCs的分离纯化。四唑盐（monotetrazolium,MTT）微量比色法检测细胞活性。结果 较高的细胞接种密度或加入顶盖提取液(tectal extract,Te)均有利于混合培养的RGCs生长存活。MTT检测法显示加Te培养的实验组其吸光度(A)值较对照组增加了3倍；在RGCs培养2天时，按细胞接种密度为1×103个/mm2的培养组较500个/mm2的培养组，有突起的细胞数多3倍以上。RGCs经Thy1.1单抗纯化，其纯化率约达95%。在无神经营养因子的条件下，纯化培养的RGCs于48h后很少存活。而混合培养的RGCs存活时间可持续2或3周。结论 在一定条件下的RGCs能够于体外培养存活，其生长存活能力依赖于靶组织及其它视网膜细胞的营养作用。采用Thy1.1单克隆抗体纯化的方法可获得高纯度的RGCs。体外培养和纯化RGCs是研究青光眼及视网膜疾患发病机制的理想模型。
The experimental research of purification and character of cultured retinal ganglion cell WU Yongqing, GE Jian, QIU Pengxin, et al. Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sun University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective To establish a cell line and purification model of retinal ganglion cells (RGCs) in vitro.Method RGCs from Sprague Dawley neonatal rats (postnatal 1-3 days) were cultured in basal medium eagle (BME) basal medium. The growth regularity of RGCs in vitro was observed under phase-contrast microscope. RGCs were purified by Thy 1.1 with FITC antibody and detected under fluorescent microscope and phase-contrast microscope.Results Higher density of retinal cells and tectal extract facilitate cultured RGCs to survive. The purification rate of retinal ganglion cells in the experiment arrived at 95 percent.Conclusion Cytokine and trophic factors from other cells in the retina and tectal extract can promote RGCs to survive, and they can be purified by Thy 1.1 antibody.
【Key words】 Cell culture Retinal ganglion cells
视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）具有高度分化的特点，出生后一般不再进行有丝分裂，因而其体外培养只属于原代培养。与其它组织相比，RGCs对培养环境的要求更高，因此要使其存活并维持一段时间，技术难度较大，培养条件也较复杂。青光眼视功能损害的主要原因是RGCs受损，研究RGCs损害的细胞和分子机制在青光眼的研究中具有重要意义。我们改进了以往的实验方法［1］，成功地进行了鼠RGCs的培养和纯化，现将结果报告如下。
材料和方法
一、实验动物
出生1～3天标准实验用Sprague-Dawley(SD)乳鼠，由中山医科大学动物实验中心提供。符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级，检证字95A05（广东省实验动物质量检测合格证号）；医动字第26-001号（广东省医学实验动物管理委员会合格证号）。
二、视网膜神经节细胞体外培养
1.培养皿的制备：采用直径35mm培养皿或96孔培养板,以0.1mg/ml多聚鸟氨酸(poly-l-ornithine,PO；硼酸缓冲液稀释,美国Sigma公司产品,P-3530）室温包被2h后，用PBS液漂洗3次，再以1μg/ml层粘连蛋白(laminin,LN；PBS液稀释，美国Sigma公司产品,C-6171）包被，37℃过夜备用。
2.取材：出生1～3天SD乳鼠，无菌条件下断头处死，解剖显微镜下分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化，37℃条件下放置20min，1000r/min离心，去除上清液。再以0.25%胰蛋白大豆抑制剂（美国Sigma公司产品，A-2268）中和。再离心，去除上清液。用含镁离子的Kreb液(含1%小牛血清白蛋白)漂洗3次，加培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀。计数后进行培养。
3.RGCs的培养：上述的单细胞悬液根据实验要求按不同的密度置入经PO和LN包被的培养皿或培养板中，BME（美国Gibco公司产品，cat#21010-20）培养基，其中含25μmol/L谷氨酰胺、10％胎牛血清、0.1mg/ml庆大霉素。置5%CO2培养箱（37℃恒温及饱和湿度）中培养。
三、RGCs鉴定
在直径35mm的培养皿中培养混合及纯化的RGCs细胞，4h后，去除培养液，4%多聚甲醛固定；再经4h后，用PBS液漂洗3次，每次5min，加羊抗鼠FITC-Thy1.1单克隆抗体（1∶100，PBS液稀释，美国Sigma公司产品，F-2887），37℃条件下放置30min。PBS液漂洗3次，荧光显微镜下观察。
四、RGCs的纯化及纯度检测
取材方法同上，以羊抗鼠IgG(1∶100，PBS液稀释,华美生物工程制品公司产品，IR-2080）室温包被直径为100mm的细胞培养皿，24h后用培养液漂洗3次，继以羊抗鼠Thy-1.1单克隆抗体（1∶150,PBS液稀释,美国Sigma公司产品，M-7898）室温下包被，2h后再以培养液漂洗3次。
在包被好的培养皿内加入视网膜单细胞悬液及培养液，37℃条件下孵育30min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合。去除悬液，用培养液反复漂洗，清除培养皿表面未粘附的细胞，用0.125%胰酶消化，收集粘附的视网膜神经节细胞，计数后进行培养和检测。
经纯化的RGCs在包被了PO和LN、直径为35mm的培养皿上培养4h后，以4%多聚甲醛固定，4h后以PBS液漂洗3次，加羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体，置37℃下30min，再以PBS液漂洗3次。分别在荧光显微镜和相差显微镜下观察计数。荧光显微镜下的阳性细胞数占同一视野中相差显微镜下细胞总数的百分比即RGCs的纯度。
五、形态学观察
相差显微镜下观察细胞生长规律，视网膜神经节细胞混合培养1天、2天及4天，以每组3个培养皿，每个培养皿中央为中心，取上、中、下3个显微镜拍照视野框（目镜10倍，物镜20倍，框面积单位mm2），计数每框细胞数（有光晕和突起的细胞），取均值，进行统计学处理。另每组随机选15个细胞，以图像分析处理系统分析细胞胞体直径及突起长度，结果经统计学处理。
六、体外培养的视网膜神经节细胞存活观察
1.混合培养的RGCs活性观察：以96孔培养板进行细胞培养，6孔为实验组，另6孔为对照组。培养开始，实验组加入顶盖提取液(tectalextract,Te)，对照组不加。Te的制备是通过取顶盖脑组织，以0.08%胰蛋白酶消化制成顶盖脑细胞悬液，离心取上清液而获得［2］。以4只出生1～3天SD鼠顶盖，制备2.5ml的顶盖提取液。Te加入量为每孔15μl，培养20h后，加入MTT（1.5mg/ml，BME培养液配制）10μl/孔，24h后在酶标仪上测吸光度(A)值。
2.纯化后的RGCs观察：以96孔培养板培养纯化的RGCs，以上述方法加入Te，并于培养后2h、24h及48h的不同时间计数存活细胞。
3.不同接种密度对细胞的作用：将96孔培养皿分成两组，一组按1000个/mm2细胞密度接种，另一组按500个/mm2细胞密度接种，分别于接种后12h、1天、2天和4天计数有突起的细胞。
七、统计学处理方法
各组间培养的细胞数比较均采用t检验。
[1] [2] [3] 下一页 |
