讨论

　　一、RGCs体外培养的取材

　　实验动物的年龄直接影响RGCs的培养结果。进行RGCs体外培养的较好取材时机是大鼠胚胎10～20天，不但获得RGCs数量多，且细胞存活能力强；缺点是大鼠的胚胎年龄难以确定,取材较困难，易被色素上皮污染。生后1～3天的乳鼠，其RGCs有丰富的分裂像，视网膜分层尚未完成，RGCs存在于内网状层，内颗粒层已经显示某些细胞的同源性。该期外网状层尚未形成，光镜下无明显的光感受器分化表现，在神经上皮和色素上皮间有明显的裂隙，使视网膜神经上皮容易与色素上皮分离，而不被色素上皮污染。

　　二、培养条件对RGCs生长存活的影响

　　通过对体外培养的RGCs形态学观察，发现RGCs生长存活与培养条件有密切关系。首先，视网膜中除神经节细胞外，还含有较多的神经胶质细胞，这些神经胶质细胞的存在对RGCs的生长存活特别重要。神经胶质细胞通过分泌胶质源性生长因子^［3］，为RGCs提供了营养支持作用。神经胶质细胞还通过与神经节细胞之间的细胞通道影响RGCs。因此当混合培养时，RGCs体外可存活2周左右，而纯化的RGCs在培养48h就很少见到存活细胞。本组研究还显示，培养至第2天，接种密度为1000个/mm²者有突起的细胞数高出500个/mm²者3倍以上。其原因可能与轴突在生长过程中分泌的调节因子（the axonal glycoprotein-1,TAG-1）对细胞突起的生长具有正性的反馈调节作用有关。

　　三、视网膜神经节细胞诱向因子（retinal ganglion neuronotrophic factor,RGNTF）对RGCs的生物学作用

　　RGCs的发育受靶组织产生的某些特定的神经诱向因子所诱导。视神经的靶组织顶盖中可提纯一种可溶性分子，周明华等^［4］对这种可溶性分子进行分离纯化，并经蛋白质鉴定，认为是一种相对分子质量为30×10³的蛋白质，命名为RGNTF。我们通过对顶盖组织的处理得到顶盖提取液，并研究其对培养RGCs的作用。实验中我们观察到顶盖提取液能够促进细胞的生长存活。RGNTF可能是其中发挥主要作用的物质。由此可见，顶盖作为RGCs的靶组织，不仅能够诱导RGCs的发育，还能促进RGCs的存活。进一步研究RGNTF对RGCs的具体作用机制及这类因子表达的基因调控，将使我们对青光眼等眼病导致视功能损害的机制及预后有更深入的认识。

　　四、RGCs的纯化及意义

　　RGCs是视网膜中分化最早的神经元，RGCs经过增殖、分化逐渐发育成熟。Thy-1.1抗原是RGCs的成熟标志，同时又是RGCs的特异性标志^［5］。有研究表明，Thy-1.1单克隆抗体能够促进RGCs的生存和再生^［6］。与以往的方法相比^［7，8］，Thy-1.1单克隆抗体用于RGCs的分离纯化,不但可获得更多的培养细胞，且可得到更高的纯度。

　　建立RGCs体外培养和纯化模型是研究青光眼及其它视网膜疾病的基础。在此基础上我们还研究了RGCs体外生长的生物学特性及顶盖提取液对RGCs生长存活的作用，发现顶盖提取液中具有促进RGCs生存的活性物质。这将为今后进一步研究RGCs的保护和死亡机制提供重要的理论依据。

　　本课题受国家自然科学基金（基金编号39770789）、广东省科委重点攻关项目基金（基金编号44）、广东省中医药管理局基金资助（基金编号97233）

　　参考文献

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　　2　周明华，赵丽萍. 中脑顶盖提取液对培养在不同支持物的初生大鼠视网膜神经节细胞生长的影响. 解剖学报, 1990,22:195-199.

　　3　Xiong WC, Montell C. Defective glia Induce neuronal apoptosis in the repo visual system of drosophila. Neurology, 1995,14: 581-590.

　　4　周明华，黄威权，任峰. 大鼠胚胎视网膜内RGNTF及其受体的免疫组织化学定位.科学通报,1992,37:1220-1222.

　　5　Barnstable CJ, Drager UC. Thy-1.1 antigen: a ganglion cell special marker in rodent retina. Neuroscience, 1984,4:847-855.

　　6　Leifer D, Lipton SA, Barnstable CJ. Monoclonal antibody to Thy-1 enhances regeneration of processes by rat retinal ganglion cells in culture. Science,1984,224:303-306.

　　7　Sarthy PV, Curtis BM, Catterall WA. Retrograde labeling, enrichment, and characterization of retinal ganglion cells from the neonatal rat. J Neurol Sci, 1983,3:2532-2544.

　　8　Armson PF, Bennett MR. Neonatal retinal ganglion cell cultures of high purity: effect of superior colliculus on their survival. Neurosci Lett, 1983,38:181-186.

(收稿：1998-10-25　　修回：1999-02-13)

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