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3 讨论
MMPs是一组由结缔组织细胞分泌，参与细胞外基质降解的蛋白酶，其活性受TIMPs(金属蛋白酶组织抑制因子)的抑制，二者的失衡涉及到正常组织的重塑、创伤愈合、肿瘤转移和许多疾病的发生。MMP-2和MMP-9同属于MMPs中的明胶酶(gelatinase)类，因其主要作用底物为基底膜成分Ⅳ型胶原而在基底膜降解疾病中引入注目。
角膜溃疡以角膜基质细胞外基质成分的大量降解丢失为特征，MMPs在这一过程中起着重要的作用。对角膜溃疡动物模型的研究表明，基质细胞外基质的降解发生在上皮下基底膜消失之后，MMP-9在这一过程中可能起主要作用。MMP-9的过量表达导致了角膜基底膜的降解，控制此酶的过量表达可能会成为阻止角膜溃疡发生的一种有效措施。MMP-2则不同，其主要作用并非促进溃疡发生过程中基底膜的降解，而是在修复组织向正常组织形态转变的重塑过程中起作用［1］。动物研究表明，在角膜溃疡发生过程中，至少有一部分MMP-9是由角膜本身的细胞所分泌的，角膜基质细胞在培养中可分泌MMP-9，为MMP-9的重要来源或重要来源之一，因此角膜成纤维细胞应成为抑制角膜中MMP-9表达的一个重要的切入点［2］。
本实验结果中可见到3条蛋白分解带，相对分子质量分别为92×103，72×103，68×103，与MMP-9，MMP-2和MMP-2的活性形式的相对分子质量相当，我们的检测结果与Laura等人在其他组织中的检测结果相似［3］。而当显色缓冲液中加入EDTA时，酶的蛋白分解作用可以被抑制，说明这种酶是一种钙离子依赖的酶。由相对分子质量和抑制实验两方面的证据，说明我们的实验结果中能够降解底物明胶的酶的确是MMP-2和MMP-9，而非其他蛋白酶，也就是说传代培养的人角膜细胞能够分泌MMP-2和MMP-9。
既往对兔角膜基质细胞的研究表明，原代培养的兔角膜基质细胞仅分泌MMP-2，不分泌MMP-9，而传代后这种情况会发生改变，传代的兔角膜基质细胞不仅分泌MMP-2，还能分泌MMP-9［4］。本研究中实验对象为传代的人角膜基质细胞，结果表明，传代培养的人角膜基质细胞也可分泌两种明胶酶，MMP-2和MMP-9。正常人角膜组织中仅能检测到MMP-2的分泌，传代培养的人角膜基质细胞与正常角膜组织间这种明胶酶分泌能力的不同，可能正是体内静止的角膜细胞激活后发生的改变的反映。
本实验还利用此方法对TGF-β对人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的作用做了一定程度的定量分析，Fini等学者曾研究TGF-β对原代培养的兔角膜细胞分泌MMP-2的作用，结果表明，TGF-β对MMP-2的分泌有一定的促进作用［5］，但该研究中实验对象为原代培养的细胞，不能恰当地反映角膜基质细胞激活后的生物学改变，并且人与兔角膜基质细胞对TGF-β作用的反应可能会具有一定的种属差异，所以在本实验中，我们采用传代培养的人角膜基质细胞为实验对象，以期准确地反映TGF-β对于激活的人角膜基质细胞分泌明胶酶的能力的作用究竟如何。
将本实验的酶谱结果进行光密度扫描可见：TGF-β可抑制人角膜基质细胞分泌MMP-9，这种作用随TGF-β质量浓度的升高而增强，随着TGF-β作用时间的延长也逐渐增强。但TGF-β对人角膜基质细胞分泌明胶酶的作用是双向性的，对MMP-2与对MMP-9的作用相反，表现为一定程度的促进作用，并且TGF-β的质量浓度和作用时间对这种作用的影响较小。且TGF-β对MMP-2的前酶形式和活性形式的作用又有不同，TGF-β对72×103 MMP-2的作用甚小，质量浓度为1ng／ml的TGF-β作用最强，仅使其活性增加至1．3倍，而0．1ng／ml和5ng／ml仅使其活性增加至1．19倍和1．06倍，相对而言，TGF-β对68×103 MMP-2的活性形式作用较为明显，各质量浓度的作用平均为1．72倍，1ng／ml的TGF-β在各时间点的作用平均为1．76倍。我们分析其原因可能与MMP-2特殊的激活机制有关［6］，MMP-2与MMPs家族中其他成员不同，其他MMP的激活剂如纤溶酶，胰蛋白酶等不能激活MMP-2，但TGF-β则是有限的几种能够激活MMP-2的物质之一，所以，本实验中检到的MMP-2活性形式的增加也许是因为TGF-β激活了MMP-2，从而主要表现为活性MMP-2的增加。
TGF-β对角膜基质细胞MMP-9的抑制作用有可能阻止MMP-9对基底膜的降解，从而阻止溃疡的发生，而TGF-β对MMP-2的一定程度的促进作用可能对基底膜降解并无明显的作用，因为MMP-2是一种主要在组织重塑过程中起作用的酶。TGF-β的这种对于明胶酶的双向作用可能是使角膜基质细胞对MMP的表达趋向于正常组织的表达方式：仅表达MMP-2，不表达MMP-9，在一些疾病如角膜溃疡中，可能正是因为TGF-β的缺乏才造成了MMP的异常表达方式，导致疾病发生［5］。
本课题受教育部留学回国人员科研启动基金资助
参考文献：
1．Fini ME，Girard MT，Matsubara M．Collagenolytic／gelatinolytic enzymes in corneal wound healing．Acta Ophthalmol．1992，70（Suppl)∶ 26
2．Fini ME，Parks WC，Rinehart WB，et al．Role of matrix metalloproteinases in failure to re-epithelizlize after corneal injury．Am J Pathol，1996，149∶1287
3．Laura Bc，Ineke DCJ，Docherty AJP，et al．Gelatinase A （MMP-2） and cysteine proteinase are essential for the degeneration of collagenin soft connective tissue．Matrix Biology，1998，17∶ 35
4．Fini ME，Girard MT．The pattern of metalloproteinase expression by corneal fibroblasts is altered with passage in cell culture．J Cell Sci，1990，97∶ 373
5．Girard MT，Matsubara M，Fini ME．Transforming growth factor-β and interleukin-1 modulate metalloproteinase expression by corneal stromal cells．Invest Ophthalmol Vis Sc，1991，32∶ 2441
6．Murphy G，Docherty AJP．The matrix metalloproteinases and their inhibitors．Am J Respir Cell Mol Biol，1992，7∶ 120
收稿：1999－ 6－30
修回：2000－05－06 上一页 [1] [2] [3] |
