【摘要】 目的：研究碱烧伤后角膜血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达与角膜新生血管的关系。
方法：普通家兔25只碱烧伤诱导角膜新生血管模型。碱烧伤后不同时间（1，3，5，7，14d）形态学分析来评价角膜新生血管的情况，免疫组化评价角膜VEGF的表达。
结果：角膜碱烧伤后24hVEGF的表达开始升高，伤后5d达高峰（阳性表达最强，遍布全层），伤后7dVEGF的表达开始下降，14d后显著下降。碱烧伤后，角膜新生血管与VEGF的表达呈明显的平行关系。
结论：碱烧伤后兔角膜VEGF的表达水平与新生血管的形成有相关性，并在其中发挥了重要作用。
【关键词】 血管内皮生长因子 角膜新生血管化 碱烧伤 兔
0 引言
角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）的形成是在各种致病因素作用下，血管生成因素和血管生成抑制因素失去平衡，血管生成因素占主导地位所致。血管化混浊的角膜不但严重影响视功能，而且使角膜的免疫赦免功能丧失，也是角膜移植失败的高危因素［1,2］。许多生长因子参与了血管生成的生理调节，其中血管内皮生长因子（VEGF）是新确定的一种具有特异性促进血管内皮细胞分裂、在新生血管的形成过程中发挥中心作用、其表达受炎性物质调节的因子［3］。我们以建立家兔角膜碱烧伤模型为依据，以形态学的方法观察伤后新生血管生成及VEGF在碱烧伤角膜中的表达情况，以揭示VEGF与角膜新生血管之间的时空关系，并为临床治疗角膜新生血管提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 小鼠抗兔VEGF单克隆抗体购自美国Lab Vision公司；生物素标记山羊抗小鼠IgG免疫组化染色试剂盒（SP9002）与浓缩型DAB试剂盒（ZLI9032）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。选用中南大学湘雅医学院实验动物学部提供的白色健康普通家兔25只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg,用裂隙灯显微镜检查兔眼角膜正常。选择右眼为实验眼，制备碱烧伤角膜新生血管模型。25只兔随机分为5组，每组5只，构成碱烧伤后1，3，5，7，14d组。
1.2方法 术前30g/L戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉注射麻醉, 5g/L丁卡因滴眼液点右眼2次后,棉签吸除结膜囊液体,将统一规格直径10mm滤纸片浸泡于1mol/L NaOH溶液中1min,达饱和状态,然后置于兔子右眼角膜中央1min,取下滤纸,用生理盐水冲洗角膜及结膜囊2min,术后3d每日滴抗生素眼药水及眼膏预防感染。
1.2.1角膜新生血管的形态学观察 兔角膜碱烧伤24h后，每日用裂隙灯显微镜观察新生血管发生的情况,至各组出现CNV后，改为隔日观察，每次均测量自角膜缘长出的CNV长度并记录、照相。测量时，以连续弯曲度小，CNV朝向角膜混浊中心生长的最长血管为准，并计算CNV生长面积A，A=C/12×3.1416［r2（rl）2］,其中C为NV累及角膜的圆周钟点数，l为NV从角膜缘伸入角膜的长度，r为角膜半径。
1.2.2免疫组织化学染色检测VEGF蛋白质的表达 各组兔子在碱烧伤后1,3,5,7,14d以空气栓塞法处死，在无菌条件下，右眼球沿角膜缘外0.5mm剪下角膜，40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5μm。以SP法（北京中杉金桥生物技术有限公司提供试剂盒）行免疫组织化学染色，具体方法如下：石蜡切片，常规脱蜡至水，30mL/L过氧化氢去离子水室温下孵育30min,PBS浸泡，加入封闭用正常山羊血清工作液室温下15min，滴加小鼠抗兔VEGF（1∶50）一抗，置湿盒于4℃过夜。PBS冲洗，滴加生物素标记山羊抗小鼠二抗室温下15min，PBS冲洗，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液室温下15min ，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片,显微镜下观察。染色结果判断：以细胞膜和/或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每次染色时均用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性对照为血管肉瘤。
2结果
2.1角膜新生血管的形态学特征 术后1d ,碱烧伤斑明显，可见角膜上皮损伤,角膜水肿,角巩膜缘血管轻度扩张充血(图1A)。术后3d,可见角巩膜缘处有新生血管芽呈刷状,角巩膜缘血管扩张充血明显(图1B)。术后5d,角巩膜缘处新生血管变长，顶端已出现分叉(图1C)。术后7d,新生血管迅速增长，其顶端分叉更加明显，部分交织成网状，局部血管已侵入碱烧伤斑(图1D)。术后14d,角膜新生血管呈垂柳状全部长入碱烧伤斑，几乎占据整个角膜，角膜中心出现凹陷透明区，同时新生血管也变得细而稀疏(图1E)。以前述方法测量并计算CNV的长度和面积, 碱烧伤后1,3,5,7,14d组,角膜新生血管的长度和面积随着时间的延长分别变长和变大（表1）。
表1 角膜碱烧伤后新生血管的长度和面积 （略）
l:长度(mm);s:面积(mm2)
2.2角膜VEGF蛋白质的表达差异 正常兔子角膜上皮层和内皮层有轻微VEGF阳性表达（图2A）。碱烧伤后24h,角膜上皮层VEGF呈染色阳性，基质层中未见VEGF的表达，角膜内未见新生血管生长（图2B）；角膜碱烧伤后3d，角膜上皮层VEGF表达明显增强，基质层开始出现炎性细胞并表达VEGF（图2C）；碱烧伤后5d，基质层内有大量炎性细胞出现并可见成熟的CNV管腔，管腔粗大，排列紧密，侵入深基质层，血管内皮细胞VEGF染色阳性，角膜组织中VEGF表达显著增强，在基质层及内皮层也出现了较强的VEGF表达（图2D）；碱烧伤后7d，角膜上皮层增厚，血管上皮细胞及角膜内皮细胞VEGF染色阳性，角膜基质层内成熟的、有功能的CNV管腔增加，管腔粗大，排列紧密，基质全层浸润有炎性细胞，而VEGF在角膜基质的表达水平降低（图2E）；碱烧伤后14d，角膜上皮层变薄并有脱落，基质层浸润的炎性细胞有所减少，成熟的CNV管腔变得更加粗大，但数量减少，内皮细胞VEGF染色减弱，角膜组织的VEGF表达水平明显降低（图2F）。
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