【摘要】 目的：探讨细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)在血液和房水中的含量变化与角膜移植排斥反应的关系。
方法：缝线法诱发兔角膜新生血管化（corneal neovascularization，CNV）后，制作穿透性角膜移植 (penetrating keratoplasty，PKP) 模型4组，A组：正常对照组；B组：自体穿透性角膜移植组；C组:同种异体穿透性角膜移植组；D组：新生血管化穿透性角膜移植组。术后记录植片存活时间和移植排斥指数（rejection index，RI）；ELISA法检测房水及外周血中可溶性ICAM1（sICAM1）的含量，免疫组化法观察ICAM1的表达。
结果：B、C组在观察期内未见排斥反应发生。D组发生排斥反应，角膜植片平均存活12.4±1.3d，术后房水及外周血中sICAM1含量即升高，至排斥反应前达最高水平分别为53.9±19.3ng/L，378.8±30.6ng/L，在排斥反应发生时，免疫组化染色发现角膜组织中ICAM1呈强阳性表达。
结论：血液和房水中的ICAM1含量可以是角膜移植免疫排斥反应发生的指标，术后监测ICAM1浓度变化对排斥反应的发生有一定预测和早期诊断作用。
【关键词】 穿透性角膜移植 排斥反应 细胞间粘附分子 兔
0引言
随着分子生物学技术的不断提高,人们对角膜移植免疫排斥反应的发生机制有了更深入的认识。在这一病理过程中，有多种机制可能参与其调控，其中细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)在近年来备受关注。ICAM1是一类具有多功能强效的生长调节因子，是免疫和炎症反应的重要调节剂，参与免疫反应的ICAM1可自表达的内皮细胞或激活的淋巴细胞上脱落，进入体液成为可溶性细胞间粘附分子1 (sICAM1)。我们观察兔角膜移植术后及其发生排斥反应时ICAM1在角膜组织和血清中的表达情况及时间关系，探讨其在角膜组织早期损伤修复反应中的作用，以及对病变进展进行预测的临床意义。
1材料和方法
1.1材料 健康清洁级新西兰白兔48只，雌雄兼用，体质量2.00～2.50kg，年龄2～3mo，购自新疆医科大学实验动物中心。右眼缝线诱发CNV后行PKP术，PKP模型分为4组，A组：正常对照组（4只兔、双眼），不进行角膜移植；B组：自体PKP组（8只兔、右眼），植片原位旋转180°；C组：同种异体PKP组（8只兔、右眼）； D组：新生血管化PKP组（16只兔、右眼）。
1.2方法 实验兔16只制作新生血管化角膜模型，右眼术前30min充分散瞳，肌肉注射氯胺酮（25mg/kg）和氯丙嗪 (12.5mg/kg)全身麻醉，并用盐酸丙美卡因滴眼液（5mL/L）滴眼3次表面麻醉，术前消毒，100丝线在右眼角膜中央区(以角膜半径内1/3)间断缝合3针(板层；针距约0.5mm)，术毕散瞳，涂氧氟沙星眼膏。当新生血管达角膜中央时拆除缝线，并于2d后进行穿透性角膜移植（PKP）。PKP模型制作时，麻醉方法同前，但剂量加倍。取健康新西兰白兔眼作为供体，供体角膜切取直径为7.75mm，用7.50mm环钻制备植床，100丝线间断缝合16针达水密状态，结膜下注射庆大霉素，线结暴露不包埋。术后涂氧氟沙星眼膏，阿托品散瞳。
1.2.1角膜移植排斥反应观察 自术后24h起，每日用裂隙灯显微镜观察受体兔直至排斥反应发生，参考Larkin等［1］制定的标准，由2人分别评分，以角膜透明度、水肿度、新生血管度为指标，记录移植排斥指数(rejection index，RI)(010分)。评分之和为RI，当RI≥5或植片混浊一项达到3时，即认为排斥反应发生并结束观察；记录各组植片的存活天数，共观察28d。
1.2.2组织病理学检查 采取新生血管化兔耳缘动脉血(约0.8 mL)，离心10min(2 000r/min)后取血清，于80℃保存。同时1mL注射器从角膜缘做前房穿刺以抽取房水0.2mL，置80℃保存。于PKP术后3，7，14，21，28d采取耳缘动脉血，取血清，排斥反应发生前(约术后第10d) B，C，D组各取3只兔子，A组取2只兔子，及观察结束时取模型兔，抽取房水80℃保存，取角膜，置于40g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，切片备用。每份标本石蜡切片均常规HE染色，光学显微镜下观察兔角膜移植术后及正常兔角膜组织、形态学改变。角膜石蜡切片行ICAM1免疫组化染色，观察其表达。
1.2.3 sICAM1含量的检测 用酶链免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法定量检测外周血及房水中sICAM1含量。另用SPSS13.0 for Windows软件分析，所有资料采用 表示，两组计量资料之间均数比较用t检验，P<0.05差异有显著性。
2结果
2.1角膜植片存活情况 D组新生血管于16.4±1.8d时达角膜中央，拆除角膜缝线2d后行PKP术。PKP术后1d，B,C,D组均可见角膜轻度水肿和混浊，随时间推移B,C组角膜植片逐渐透明,9d时植片和植床交界处均可见新生血管，在观察期间内无1例发生排斥；D组角膜植片水肿、混浊逐渐加重，厚度逐渐增加，RI较B,C组增高，D组术后8～10d新生血管开始长入移植片,平均11d角膜后纤维素样渗出，中度虹膜睫状体炎，有的出现植片的溶解，该组兔均发生排斥反应,植片存活12.4±1.3d。
2.2组织病理学检查 HE 染色可见正常兔角膜分为5层，上皮层（表层细胞、翼状细胞、基底细胞）、前弹力层（不连续）、基质层、后弹力层、内皮层，胶原纤维呈板层排列(图1A)；在观察周期末，B、C组植片轻度增厚，浅基质层有极少炎性细胞浸润，植床侧可见少量新生血管，各层排列整齐（图 1B），上皮、内皮完整。D组发生排斥反应时，植片明显增厚，炎性细胞布满全层，上皮下有积液，基质结构紊乱，有大量新生血管（图 1C），部分内皮消失。免疫组化染色发现在正常角膜中，ICAM1在角膜上皮细胞（表层细胞）、基质细胞（86%切片）有基本量表达(图2A)，而内皮细胞几乎无表达。发生排斥反应的植片中，ICAM1在角膜新生血管内皮细胞中表达明显增强，在部分单核细胞、淋巴细胞浸润部位表达亦明显增强(图2B，C)。
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